Sexo

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 320 (2023) Citar este artículo

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Estudios recientes del metabolismo animal han revelado una gran cantidad de metabolitos nuevos que están involucrados en todos los aspectos de la biología del organismo, pero no está claro hasta qué punto los metabolomas difieren entre sexos. Aquí, utilizando metabolómica comparativa no dirigida para el análisis de animales de tipo salvaje y mutantes para la determinación del sexo, mostramos que los hermafroditas y los machos de C. elegans exhiben diferencias metabolómicas generalizadas. Varios cientos de moléculas pequeñas se producen exclusivamente o en cantidades mucho mayores en un sexo, incluida una serie de metabolitos no reportados previamente que incorporan componentes básicos del metabolismo de nucleósidos, carbohidratos, lípidos y aminoácidos. Un subconjunto de metabolitos enriquecidos en hombres se asocia específicamente con la presencia de una línea germinal masculina, mientras que el enriquecimiento de otros compuestos requiere un soma masculino. Además, mostramos que uno de los metabolitos dependientes de la línea germinal masculina, un dipéptido inusual que incorpora N, N-dimetiltriptófano, aumenta el consumo de alimentos, reduce la esperanza de vida y acelera la última etapa del desarrollo larvario en los hermafroditas. Nuestros resultados sirven como base para estudios mecanicistas sobre cómo el sexo genético del soma y la línea germinal dan forma al metaboloma de C. elegans y proporcionan un modelo para el descubrimiento de metabolitos dependientes del sexo en otros animales.

Estudios recientes sobre el metabolismo y las respuestas fisiológicas relacionadas en humanos y en modelos de roedores han revelado diferencias dramáticas entre sexos1,2,3,4,5. Por ejemplo, el análisis metabolómico dirigido del suero humano reveló diferencias significativas para un tercio de los metabolitos anotados6. Sin embargo, pocos estudios en cualquier sistema modelo han aprovechado el poder de los enfoques metabolómicos no dirigidos basados ​​en espectrometría de masas de alta resolución HRMS para descubrir metabolitos novedosos y no anotados asociados con el sexo.

Los análisis metabolómicos no dirigidos basados ​​en HRMS en varias especies han revelado una gran diversidad metabólica, incluida una gran cantidad de metabolitos cuyas estructuras químicas aún no se han determinado7,8. La interpretación de los grandes conjuntos de datos resultantes generalmente se basa en análisis comparativos de muestras de diferentes condiciones biológicas, lo que permite identificar metabolitos que están significativamente asociados con un contexto de interés y, por lo tanto, pueden priorizarse para una caracterización química detallada8,9,10,11. Por lo tanto, la metabolómica comparativa de diferentes sexos basada en HRMS tiene el potencial de descubrir metabolitos no anotados cuya identificación puede avanzar en la comprensión mecanicista de los fenotipos específicos del sexo y complementar la transcriptómica y proteómica.

En el nematodo modelo C. elegans, los análisis metabolómicos orientados al descubrimiento12,13 se han centrado casi exclusivamente en el sexo predominante, los hermafroditas autofértiles, que representan >99% de las poblaciones en condiciones estándar14, mientras que los metabolomas de los mucho menos Los machos abundantes se han estudiado sólo de forma limitada. Los machos y los hermafroditas difieren considerablemente: más de 5500 genes, o ~1/3 de todo el transcriptoma que codifica proteínas, se expresan de manera diferencial entre los dos sexos15,16. En consecuencia, existe cada vez más evidencia de diferencias importantes específicas de cada sexo en el metabolismo, la respuesta a la enfermedad y otros fenotipos en C. elegans17,18,19,20,21.

Un subconjunto intrigante de diferencias metabólicas entre los sexos está compuesto por pequeñas moléculas excretadas con las que se comunican los animales. Varios estudios recientes describen diversos rasgos de la historia de vida afectados por tales feromonas específicas de cada sexo. El caso mejor estudiado involucra un par de derivados de ascarósidos que tienen estructuras químicas casi idénticas (Fig. 1a) pero que están enriquecidos en hermafroditas (ascr#3, 1) o en machos (ascr#10, 2)22. En concentraciones fisiológicas, el ascr#10 específico para hombres ejerce efectos que parecen opuestos a los efectos del ascr#323, incluido un comportamiento exploratorio reducido de los hermafroditas24,25, aspectos mejorados de la función de la línea germinal26,27,28 y una esperanza de vida más corta27,29. Más recientemente, informamos sobre un conjugado inusual de ácido graso y aminoácido, nacq#1 (3), que también acorta la vida útil de los hermafroditas29, contribuyendo así a un fenómeno de muerte inducida por los machos, por el cual los hermafroditas mueren más rápidamente en presencia de machos. compuestos excretados19,30,31. Además de reducir la esperanza de vida de los hermafroditas, nacq#1 acelera la última etapa del desarrollo larvario, lo que resulta en una maduración sexual más rápida29.

a Metabolitos con sesgo sexual previamente caracterizados en C. elegans. Mientras que ascr#3 (1) es más abundante en hermafroditas, ascr#10 (2) y nacq#1 (3) son más abundantes en machos. b Comparación de los metabolomas de WT y mutantes him-5 (e1490) enriquecidos en hombres. El gráfico del volcán muestra el subconjunto de características detectadas por HPLC-HRMS en modo de ionización positiva (ESI +), resaltando características aumentadas (rojo) o disminuidas (azul) en him-5 en relación con los extractos de endo-metaboloma WT. Los valores de P se calcularon mediante pruebas t bilaterales no apareadas; consulte "Análisis de Metaboseek" para obtener más detalles. c Configuración experimental para monitorear el metabolismo de animales WT y him-5 con recolección periódica del exometaboloma; Jóvenes adultos jóvenes. d Planes corporales simplificados de hermafroditas WT y machos WT, así como fem-2(b245) (lf) feminizada con línea germinal, fem-3(q20) (gf) masculinizada con línea germinal, glp-4(bn2) deficiente en línea germinal, y Mutantes Pnhx-2::fem-3 masculinizados intestinalmente. Los tejidos están codificados por colores según el sexo; soma hermafrodita (morado oscuro), soma masculino (azul oscuro); línea germinal femenina rosa), línea germinal masculina (azul) con esperma (puntos oliva) e intestino masculino (azul claro). Reimpreso de la ref. 61 con permiso de Elsevier. e Esquema de animales WT hermafroditas y enriquecidos con machos cultivados en placas para metabolómica. f Diagrama de Venn de metabolitos enriquecidos en machos detectados a partir de mutantes him-5, mutantes fem-3(gf), mezclas 1:1 de machos WT y hermafroditas, y machos WT cuidadosamente seleccionados. g Abundancia de nacq#1 (3) en extractos de exometaboloma de mutantes de la línea germinal en relación con hermafroditas WT. Los datos representan cuatro o seis experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon utilizando los datos brutos transformados log10 y las pruebas t de Welch bilaterales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los estudios de ascr#10 y nacq#1 demostraron que los metabolitos específicos del sexo pueden tener efectos importantes en la historia de vida de C. elegan y sugieren que la identificación de compuestos adicionales específicos del sexo contribuirá significativamente a una comprensión mecanicista de varios aspectos de C. elegans. biología. Aquí, presentamos un estudio completo y no específico de las diferencias entre los metabolomas masculinos y hermafroditas, incluido el papel de las líneas germinales masculinas y femeninas en las diferencias observadas. Los datos metabolómicos de este estudio proporcionan un recurso para una futura exploración detallada de las vías metabólicas y los fenotipos con sesgo sexual.

Una de las razones del conocimiento relativamente escaso del metaboloma masculino de C. elegans es la baja abundancia de machos en la cepa de laboratorio de tipo salvaje (WT), N2 Bristol. En condiciones de laboratorio estándar, los cultivos WT consisten casi en su totalidad en hermafroditas autofertilizantes que portan dos cromosomas X, mientras que los machos con un solo cromosoma X constituyen <1% de la población32. Aunque el apareamiento entre hermafroditas y machos puede producir hasta un 50% de descendencia masculina, esta forma de reproducción se produce principalmente en placas y con menos eficacia en cultivos líquidos. La baja frecuencia de machos y la necesidad de placas para el apareamiento hacen que no sea práctico preparar grandes muestras de animales según sea necesario para análisis metabolómicos en profundidad.

Por lo tanto, comenzamos nuestros análisis con una comparación de los metabolomas de los cultivos WT, que consisten principalmente en hermafroditas, y los cultivos mutantes him-5 (e1490), que contienen hasta un 40% de machos (Fig. 1b). Los animales him-5(e1490) portan una mutación que aumenta la probabilidad de no disyunción de los cromosomas X durante la meiosis, lo que resulta en una mayor incidencia de machos, independientemente del apareamiento32. Para distinguir los metabolitos que se excretan principalmente, analizamos por separado extractos de los medios de cultivo (exometaboloma) y los cuerpos del gusano (endometaboloma). A continuación, consideramos que el metabolismo sufre cambios profundos durante el desarrollo y a lo largo de la vida adulta. El conocimiento de las etapas de desarrollo durante las cuales se producen podría ayudar a dilucidar las funciones biológicas y la biosíntesis de compuestos específicos de cada sexo. Con este fin, examinamos el exometaboloma de los cultivos him-5 recolectando los medios de cultivo durante diferentes períodos de tiempo durante el desarrollo larvario y la edad adulta (Fig. 1c).

Las muestras de metaboloma se analizaron mediante cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución (LC-HRMS). El análisis bioinformático de los datos resultantes se realizó utilizando la plataforma Metaboseek, que proporciona un conjunto completo de herramientas para la metabolómica comparativa (ver “Métodos”8). Nuestro análisis de los exo y endo-metabolomas de los cultivos WT y him-5 arrojó 110,184 características significativas (pares únicos de relaciones masa-carga (m/z) y tiempos de retención), incluidas 8225 características al menos dos veces más abundantes en los cultivos him-5 enriquecidos con hombres y 22,538 características de EM que son al menos dos veces más abundantes en los cultivos WT (Fig. 1b). La curación manual para eliminar isótopos, aductos y fragmentos produjo casi 300 compuestos únicos que están regulados positivamente en cultivos de him-5 enriquecidos con machos, y un número similar de compuestos enriquecidos en WT en relación con él-5. Después de un análisis comparativo de los datos de LC-HRMS, adquirimos espectros de fragmentación de MS2 para todos los metabolitos enriquecidos en hombres (Datos complementarios 1 a 3).

Tanto la línea germinal como los tejidos somáticos difieren entre los dos sexos y, por lo tanto, podrían contribuir a las diferencias detectadas entre los animales him-5 y WT. Los hermafroditas autofértiles de C. elegans producen un alijo de ~300 espermatozoides, varias veces menos que los machos, antes de pasar a la ovogénesis33. Para comenzar a desenredar fuentes potenciales de diferencias metabólicas, aprovechamos tres mutaciones condicionales que, a una temperatura no permisiva, alteran aspectos de la biología de la línea germinal (Fig. 1d). Los individuos XX (normalmente hermafroditas) que portan el alelo de ganancia de función (gf) fem-3(q20) tienen una línea germinal masculinizada que produce una cantidad dramáticamente mayor de espermatozoides y ningún óvulo, pero no muestran una masculinización abierta en el soma34. Por el contrario, los individuos XX que portan el alelo de pérdida de función (lf) fem-2(b245) tienen una línea germinal feminizada que produce óvulos pero no esperma35. La tercera mutación que utilizamos en este estudio, glp-4(bn2), limita gravemente el desarrollo de la línea germinal (~1% del número de núcleos de la línea germinal de tipo salvaje), al tiempo que mantiene un soma aparentemente normal36, aunque un alelo probablemente nulo causa letalidad larvaria37 . Además de analizar grandes cultivos líquidos de las tres cepas mutantes (fem-3, fem-2 y glp-4), analizamos muestras pequeñas, seleccionadas a mano y derivadas de placas, que eran demasiado pequeñas para permitir análisis metabolómicos extensos. pero suficiente para verificar nuestros resultados. De esta manera, confirmamos que muchos de los compuestos enriquecidos en los mutantes him-5 y fem-3(gf) estaban enriquecidos en machos WT y en una mezcla 1:1 de machos WT (derivados por choque térmico) y hermafroditas (Fig. 1e). También utilizamos muestras cuidadosamente seleccionadas para delimitar aún más los tejidos somáticos que probablemente estén involucrados en la producción de pequeñas moléculas con sesgo sexual. Análisis metabolómicos previos de C. elegans identificaron el intestino como una fuente somática importante de biosíntesis de moléculas pequeñas11. Por lo tanto, analizamos la producción de compuestos enriquecidos en machos en hermafroditas con intestinos masculinizados, centrándonos en moléculas cuyas abundancias no se alteraron significativamente en mutantes de la línea germinal. Se obtuvieron gusanos intestinalmente masculinizados expresando el regulador sexual masculino FEM-3 bajo el control del promotor del gen nhx-2 (Pnhx-2::fem-3)38,39.

La comparación de los metabolomas de los animales him-5 y los animales fem-3 (gf) masculinizados con línea germinal reveló que 93 de los 295 compuestos enriquecidos con him-5 también estaban regulados positivamente en cultivos de fem-3 (gf) (Fig. 1f), lo que sugiere que La producción de este subconjunto de metabolitos está asociada con la presencia de la línea germinal masculina, mientras que la producción de los 202 compuestos enriquecidos en him-5 restantes puede depender del soma masculino u otros cambios en el metabolismo en mutantes de him-5. La mayoría de los metabolitos enriquecidos en hermafroditas fem-3(gf) en relación con WT también se enriquecieron en relación con los mutantes fem-2(lf) feminizados con línea germinal y glp-4 sin línea germinal, lo que respalda aún más que estos metabolitos dependen de la presencia de línea germinal masculina (Datos complementarios 1-3). Un ejemplo de un metabolito enriquecido en him-5 que depende de la presencia de la línea germinal masculina es el regulador del desarrollo nacq#1, que previamente se demostró que los machos lo producen en cantidades mucho mayores que los hermafroditas29. La cuantificación de nacq # 1 en los mutantes de la línea germinal mostró que este metabolito se producía abundantemente en animales fem-3 (gf) masculinizados, pero estaba ausente en los hermafroditas fem-2 (lf) feminizados y glp-4 sin línea germinal (Fig. 1g). La abundancia de nacq # 1 se mantuvo sin cambios en los hermafroditas Pnhx-2 :: fem-3 masculinizados intestinalmente (Figura complementaria S1a). La comparación de los metabolomas de los cultivos de fem-3 (gf), him-5 y WT reveló 11 compuestos adicionales enriquecidos con him-5 que se omitieron en la comparación inicial de los metabolomas de him-5 y WT (Datos complementarios 1-3) .

Para la caracterización química de los metabolitos enriquecidos en hombres, inicialmente priorizamos los compuestos asociados con la presencia de la línea germinal masculina, es decir, aumentados en él-5 y en fem-3 (gf) en comparación con los cultivos WT. El análisis de las fórmulas moleculares y las redes MS2 para el conjunto de compuestos resultante reveló varias familias diferentes de metabolitos probablemente relacionados estructuralmente. Para un análisis en profundidad, luego seleccionamos miembros representativos y más abundantes de estas familias que también podrían detectarse en muestras de machos WT.

Entre los metabolitos enriquecidos en hombres priorizados en los endometabolomas, detectamos varias familias de compuestos cuyas fórmulas moleculares y patrones de fragmentación de MS2 sugirieron que representan derivados de nucleósidos inusuales. Estos incluían dos compuestos isoméricos (m/z 340,1074, C13H18N5SO4+, 6,69 y 7,30 min) que se fragmentaron de una manera casi idéntica (Fig. 2a), siendo el compuesto que eluyó más tarde el isómero predominante. Los fragmentos de MS2 consistentes con sulfuro de metilmetilen (m/z 61.0104, C2H5S+) y adenina (m/z 136.0608, C5H6N5+) sugirieron que los dos compuestos representan derivados O-acetilados de S-metiltioadenosina (MTA), un metabolito común aguas abajo de S-adenosilmetionina ( SAM)40. La acetilación de MTA produjo una mezcla de dos isómeros con el mismo tiempo de retención que los compuestos naturales (acemta#1, 4 y acemta#2, 5), confirmando sus estructuras (Figuras complementarias 2 y 3).

una fragmentación MS2 de acemta#2 (5) en modo de ionización positiva (ESI+). b Abundancia de acemta#2 en extractos de endo-metaboloma de mutantes fem-2 (lf), fem-3 (gf) y glp-4 en relación con WT. Los datos representan cuatro o seis experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon utilizando los datos brutos transformados log10 y las pruebas t de Welch bilaterales. c Comparación de los niveles de acemta#2 en machos WT seleccionados a mano y hermafroditas WT seleccionados a mano. Los datos representan dos experimentos biológicamente independientes y las barras de error representan la media ± sem d Comparación de los niveles de acemta#2 en adultos jóvenes y adultos mayores (día 7) him-5. Los datos representan dos (adultos del día 7) y cuatro (adultos jóvenes) experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem Estructuras y especificidad sexual de los derivados de glucósidos de ácido úrico que incorporan el ascarósido de cadena lateral de 7 carbonos, ascr#1 (12 ). Se muestran cromatogramas de iones obtenidos en el modo de ionización ESI de WT y muestras de endometaboloma him-5. f Derivados adicionales de glucósidos de ácido úrico enriquecidos en hombres, uglas#104 (10) y uglas#105 (11), que incorporan un ascarósido de cadena lateral de 9 carbonos, ascr#10 (2). g Abundancias de ascarósidos que contienen glucósido de ácido úrico (uglas#) en extractos de endometaboloma de (g) him-5 (azul claro) en relación con los machos WT (púrpura), h WT (azul oscuro) y machos him-5 (azul rayado) en relación con los hermafroditas WT (púrpura), i mutantes de la línea germinal fem-2 (lf) (rosa claro), fem-3 (gf) (azul) y glp-4 (gris) en relación con WT (púrpura), y j animales masculinizados intestinalmente (azul) en relación con hermafroditas WT (púrpura). Las barras en g – j representan la media ± sem con cuatro a seis (g, i) y dos (h, j) réplicas biológicas independientes. Los valores de P se calcularon mediante pruebas t de Welch bilaterales con corrección de Holm-Šídák; ns, no significativo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La producción de acemta#1 y acemta#2 parece estar asociada con la presencia de la línea germinal masculina, ya que los dos compuestos son indetectables en animales feminizados fem-2(lf) y glp-4 sin línea germinal, mientras que están muy enriquecidos en animales fem-3 (gf) masculinizados en comparación con hermafroditas WT (Fig. 2b). acemta#1 y acemta#2 también se enriquecieron en muestras de machos seleccionados a mano (Fig. 2c). A diferencia de las feromonas ascarósidas y nacq#122,29, estos derivados de nucleósidos se acumulan principalmente en el cuerpo del gusano y su abundancia aumenta en los gusanos más viejos (Fig. 2d). La abundancia del supuesto precursor de acemta#1/2, MTA, no aumenta significativamente en los mutantes him-5 o fem-3(gf) (Figura complementaria 4).

Además de acemta#1 y acemta#2, detectamos una familia de compuestos cuyos espectros MS2 sugirieron que representan nucleósidos a base de hexosa, incluida una serie de supuestos derivados del ácido úrico. Las fórmulas moleculares y los espectros MS2 de los dos miembros de esta familia más dramáticamente enriquecidos (75 y 23 veces más que WT en el endometaboloma him-5) (m/z 587.2211, C24H36N4O13 y m/z 667.1880, C24H37N4PO16) sugirieron que representan isómeros de los recientemente descritos uglas#1 (6) y uglas#11 (7), dos gluconucleósidos que incorporan ácido úrico y el ascarósido ascr#1 (Fig. 2e, f)41. Sin embargo, uglas#1 y uglas#11, que llevan un resto ascr#1 en la posición 2 de la glucosa, tenían tiempos de retención significativamente más tempranos que sus isómeros enriquecidos en machos y estaban prácticamente ausentes en los mutantes him-5. Basándonos en la reciente identificación de una serie de glucósidos 6'-O-acilados de C. elegans42,43, planteamos la hipótesis de que en los isómeros enriquecidos en machos de uglas#1 y uglas#11, el resto ascarósido está unido a la posición 6. del glucósido de ácido úrico. La comparación de los espectros MS2 y los tiempos de retención de una muestra sintética del isómero 6'-O-sustituido de uglas#1, denominado uglas#14 (8), estableció que el isómero enriquecido en macho es en realidad uglas#14 y, por tanto, el El isómero enriquecido en macho de uglas#11 se asignó como su derivado fosforilado, uglas#15 (9, Fig. 2f y Figs. Suplementarias 5 y 6). uglas#14 y uglas#15 estaban acompañadas por dos compuestos con patrones de fragmentación análogos (Figuras complementarias 7 y 8), que parecían incorporar el ascarósido de cadena lateral de 9 carbonos, ascr#10, en lugar de la cadena lateral de 7 carbonos ascr#1. . Estos compuestos, denominados uglas#104 (m/z 615.2531, C26H40N4O13, 10) y uglas#105 (m/z 695.2189, C26H41N4PO16, 11), estaban aproximadamente tres a cuatro veces enriquecidos en el endometaboloma him-5 en comparación con Los cultivos WT, mientras que uglas#14 y uglas#15 se enriquecieron entre 20 y 60 veces (Fig. 2g). Se ha demostrado que la biosíntesis de uglas#1 y uglas#11 2'-O-acilados requiere la carboxilesterasa cest-1.1, que media la unión del ascarósido al 2'-hidroxi de los gluconucleósidos del ácido úrico42. La producción de metabolitos de la familia uglas 6'-O-acilados con regulación positiva masculina no depende de cest-1.1 y no requiere ninguno de los otros homólogos de cest caracterizados hasta ahora42,43, lo que sugiere que está involucrada una carboxilesterasa diferente.

Los cuatro metabolitos de la familia uglas# enriquecidos en machos que se enriquecieron en los endometabolomas de grandes cultivos de him-5 también se enriquecieron en pequeñas muestras seleccionadas a mano de machos N2 y him-5 (Fig. 2h). Como fue el caso con los cultivos más grandes de him-5, la producción de uglas#11 2'-O-acilado disminuyó significativamente o incluso fue abolida en muestras de machos recolectadas a mano en relación con los hermafroditas WT, mientras que las abundancias de 6'-O El isómero acilado, uglas # 15 y uglas # 104/105 aumentaron dramáticamente (Fig. 2h). Al igual que acemta#1 y acemta#2, los metabolitos de la familia uglas# se retuvieron predominantemente dentro del cuerpo del gusano y, por lo tanto, nuestra configuración experimental para determinar los cambios de abundancia durante la vida adulta (ver Fig. 1c) solo permitió la comparación de abundancias. en adultos jóvenes y adultos de 6 días, lo que indicó un aumento modesto de uglas#104 y uglas#105 en gusanos adultos del día 6 (Figura complementaria 9).

A diferencia de otros metabolitos enriquecidos en machos, incluidos nacq#1 y acemta#1/2, la producción de metabolitos de la familia uglas# enriquecidos en machos no dependía estrictamente de la presencia de una línea germinal masculina (o femenina). Las abundancias de los metabolitos de la familia uglas# específicos de los machos no se redujeron en los animales feminizados fem-2(lf) en relación con WT, solo aumentaron ligeramente en los animales masculinizados fem-3(gf), y se enriquecieron ligeramente o no cambiaron en los animales de la línea germinal. menos animales glp-4 en relación con WT (Fig. 2i). Esto sugirió que la producción de metabolitos de la familia uglas# depende principalmente del sexo de los tejidos somáticos. De hecho, encontramos que el perfil de los metabolitos de la familia uglas# en el endometaboloma de los hermafroditas Pnhx-2 :: fem-3 masculinizados intestinalmente se parece mucho al de los machos (Fig. 2j).

Varios estudios recientes han demostrado que el ascarósido ascr#10, el primer metabolito de C. elegans enriquecido en hombres22, tiene amplios efectos sobre el desarrollo y la fisiología de los hermafroditas24,25,26,27,28,29. El trabajo original que informó niveles elevados de ascr#10 en machos se basó en el análisis de cultivos de him-5 en estadios mixtos, que contenían animales en diferentes estadios larvales y edades de edad adulta. En estos cultivos him-5, se encontró que ascr#10 estaba regulado positivamente aproximadamente tres veces22. Nuestro estudio de exometaboloma durante el desarrollo larvario y la edad adulta reveló que solo se producen trazas de ascr#10 durante las cuatro etapas larvarias (L1-L4), y que la producción aumenta dramáticamente en los adultos jóvenes. En los cultivos him-5, la secreción de ascr#10 aumentó hasta el día 4 de la edad adulta y fue aproximadamente diez veces mayor que en los cultivos WT a partir de adultos jóvenes y durante todo el transcurso del experimento (Fig. 3a). La producción de ascr#10 se mantuvo prácticamente sin cambios con respecto a los niveles de WT en los tres mutantes de la línea germinal probados, pero aumentó considerablemente en los hermafroditas Pnhx-2 :: fem-3 masculinizados intestinalmente (Fig. 3b). Estos animales también mostraron una gran disminución en la producción de ascr#3 (Figura complementaria 1c), cuya síntesis tiene un sesgo hermafrodita22. Estos resultados son consistentes con estudios previos que mostraron que la mayor parte de los ascarósidos secretados se derivan de la biosíntesis intestinal11 y además indican que el estado sexual del intestino es suficiente para implementar patrones típicos del sexo en la producción de estas feromonas.

a Producción dependiente de la etapa de desarrollo de ascr#10 (2) en extractos de exometaboloma de WT (púrpura) y him-5 (azul claro) (izquierda) y producción acumulada de ascr#10 por WT y him-5 de la larva L1 etapa hasta el día 4 de la edad adulta (derecha). Los datos representan dos o tres experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon mediante pruebas t de Welch bilaterales. b Abundancia de ascr#10 en mutantes de la línea germinal (izquierda) y animales Pnhx-2::fem-3 masculinizados intestinalmente (derecha) en relación con WT. Los datos representan de tres a seis experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon mediante pruebas t de Welch bilaterales. c, d Estructuras químicas (c) y abundancias relativas (d) de derivados de ascarósidos de cadena lateral C7 enriquecidos en macho en extractos de exo- (ascr#1, phascr#11, glas#1, glos#1, ascr#801, y dasc#13) y endometabolomas (glas#11, glos#11, anglas#2 y tyglas#1) de animales WT (púrpura) y him-5 (azul claro). e Producción dependiente de la etapa de desarrollo de metabolitos derivados de ascarósidos que se muestra en (c) en animales him-5. Los datos representan tres réplicas biológicas independientes, excepto dos réplicas biológicas independientes para el día 7. f Abundancias de derivados de ascarósido de cadena lateral C7 en extractos de mutantes de la línea germinal fem-2(lf) (rosa claro), fem-3 (gf) (azul) y glp-4 (gris) en relación con WT (púrpura). d, f Los datos representan cuatro o seis experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de Welch bilateral no apareada con corrección de Holm-Šídák; ns no significativo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además de ascr#10, nuestro análisis comparativo de los cultivos de him-5 y WT reveló cantidades significativamente mayores del ascarósido ascr#1 (12) (Figura complementaria 10) y una serie de derivados de ascarósido estructuralmente más complejos, principalmente en el him. -5 endo-metaboloma (Fig. 3c, d). Estos incluyeron el phascr#11 fosforilado (13) y el glucósido glas#1 (14)44,45 descrito previamente, que se identificaron basándose en el análisis de los espectros de MS2 (Figuras complementarias 11 y 12) y la comparación de los tiempos de retención. Los espectros MS2 permitieron además proponer estructuras para varios compuestos adicionales (Figs. 13 a 17 complementarias), incluido un derivado fosforilado glas#11 (15), los conjugados previamente descritos de ascr#1 con glucósidos del ácido antranílico anglas#1 (16)11 y anglas#2 (17), un supuesto ascr#1-derivado del glucósido de tiramina43 tyglas#1 (18), un supuesto ascarósido dimérico46 dasc#13 (19) y un conjugado de ascr#1 y ácido p-amino benzoico ascr# 801 (20), que representa un derivado dihidro del conocido componente de feromona dauer ascr#8 (21)47. Los glucósidos glas#1 y glas#11 estuvieron acompañados por isómeros de elución posterior con espectros MS2 casi idénticos (Figuras complementarias 12 y 13) que probablemente representan glos#1 (22) y glos#11 (23), que presentan un ω -cadena de ácido graso oxigenado en lugar de (ω-1)-oxigenado en ascr#1, glas#1 y glas#11.

La excreción de la mayoría de los ascarósidos regulados positivamente por him-5, incluido el propio ascr # 1, alcanzó su punto máximo temprano en la vida, ya sea alrededor de la muda de L4 a adulto joven o el primer día de la edad adulta (Fig. 3e). De manera similar, los derivados de ascr#1 retenidos principalmente en el cuerpo del gusano fueron más abundantes en adultos jóvenes que en adultos del día 6 (Figura complementaria 18). En una excepción interesante, ascr#801, que apenas se produjo temprano en la vida, fue más abundante en animales más viejos (~día 6 de edad adulta). De manera similar a los nucleósidos de la familia uglas# descritos anteriormente, la abundancia de la mayoría de los derivados de ascr#1 enriquecidos con him-5 no se correlacionó con la presencia de una línea germinal masculina (Fig. 3f). Sin embargo, a diferencia de la familia de compuestos uglas#, la mayoría de los derivados de ascr#1 enriquecidos con him-5 no se enriquecieron o no pudieron detectarse en muestras de hermafroditas intestinalmente masculinizados o machos puros (Figura complementaria 19), lo que sugiere que La producción de metabolitos relacionados con ascr#1 puede estar regulada positivamente en respuesta a interacciones entre hombres y hermafroditas.

La comparación de los exo y endometabolomas de los animales him-5 y WT reveló una pequeña familia de metabolitos enriquecidos en machos cuyos espectros MS2 sugirieron que representan derivados dipéptidos. El espectro MS2 del miembro más abundante de esta familia de compuestos (medip#1, m/z 344,1978, C19H26N3O3−, 7,94 min) mostró fragmentos que sugieren la presencia de supuesto indol (m/z 116,0512, C8H6N−), y (iso) restos de leucina (m/z 130.0872, C6H12NO2-), así como fragmentos consistentes con la pérdida de metilindol (m/z 215.1413, C10H19N2O3-), pérdida de CO2 y dimetilamina (m/z 255.1516, C16H19N2O-) y pérdida de CO2. (m/z 300,2102, C18H26N3O-) (Fig. 4a). Este patrón de fragmentación sugirió un dipéptido que consta de N,N-dimetiltriptófano y leucina o isoleucina. Para confirmar estas asignaciones y diferenciar entre la incorporación de leucina o isoleucina, sintetizamos los dos compuestos candidatos (Fig. 4b). La dimetilación del triptófano con formaldehído y cianoborohidruro de sodio produjo N,N-dimetiltriptófano (24), que luego se conjugó con O-tBu-leucina u O-tBu-isoleucina, seguido de desprotección con ácido trifluoroacético10. La comparación de los tiempos de retención y los espectros MS2 de los isómeros 25 y 26 mostraron que este metabolito enriquecido en hombres representa N, N-dimetiltriptófano-isoleucina, que denominamos medip#1 (26, Fig. 4c y Fig. Suplementaria 20). medip#1 estuvo acompañado por cantidades más pequeñas del correspondiente N-óxido, medip#2 (27, figura complementaria 21) y el derivado monometilado medip#3 (28).

a Estructuras químicas de medip#1–3 (26–28) y fragmentación MS2 de medip#1 (26) en modo ESI. b Síntesis de medip#1 y moléculas relacionadas. c Cromatogramas iónicos para m/z 346.2125 y 349.2294, correspondientes a medip#1 y D3-medip#1, de extractos de exometaboloma de animales him-5 suplementados con D3-Met y una muestra sintética que contiene medip#1 (26) y su isómero derivado de Leu (25). d, f Abundancia de medip#1 en extractos de exo-metaboloma de (d) him-5 en relación con WT, e mezclas 1:1 macho:hermafrodita en relación con hermafroditas WT, y f indicó mutantes de línea germinal en relación con WT. Los datos representan cuatro (d), dos (e) y cuatro o seis (f) experimentos biológicamente independientes, y las barras de error representan la media ± sem. Los valores de P se calcularon mediante pruebas t de Welch bilaterales; ND, no detectado. g Producción dependiente de la etapa de desarrollo de medip#1 en animales WT (púrpura) y him-5 (azul claro). Los datos provienen de tres réplicas biológicas independientes, excepto dos réplicas biológicas independientes para el día 7. h Abundancia de medip#1 en el exometaboloma de mutantes him-8 de C. briggsae enriquecidos en machos en relación con WT C. briggsae. Los datos representan cinco experimentos biológicamente independientes. i Adquisición más rápida de ovocitos en hermafroditas expuestas a 2 nM de medip#1 (rojo) en comparación con controles emparejados (azul). Los cuadros representan los dos cuartiles internos, las líneas horizontales representan las medianas y los bigotes se extienden hasta 1,5 veces los datos del cuadro. Los datos representan un experimento con n = 25 animales para cada condición; Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. j Los hermafroditas expuestos a 2 nM de medip#1 (rojo) ovulan antes que los controles (azul). Los datos representan un experimento con n = 25 animales para cada condición. Las diferencias a las 54 h y 56 h son significativas (P = 1,7 × 10−3 y P = 7 × 10−3, respectivamente, según se calcula mediante la prueba binomial). k Bombeo faríngeo más rápido en hermafroditas tratados con 2 nM de medip#1 (rojo) que en los controles no tratados (azul). Los cuadros representan los dos cuartiles internos, las líneas horizontales representan las medianas y los bigotes se extienden hasta 1,5 veces los datos del cuadro. Los datos representan un experimento con n = 30 animales para cada condición; El valor de p se calculó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. l Momento de la primera puesta de huevos de gusanos aislados en diferentes concentraciones de medip#1 y nacq#1 en comparación con gusanos aislados no tratados (ISO, control) y gusanos agrupados (alta densidad, HD). Los datos representan cuatro experimentos biológicamente independientes, excepto medip#1 10 µM y nacq#1 1 pM (un experimento) y nacq#1 10 pM (tres experimentos), con el número total de animales utilizados para cada condición indicado arriba de la x. eje. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de Welch bilateral, comparando las condiciones indicadas con el control ISO. m Esperanza de vida media de los animales WT tratados con medip#1 en comparación con el control no tratado. Los datos representan de tres a cuatro experimentos biológicamente independientes, cada uno con 15 a 20 animales por placa; el número total de placas utilizadas para cada condición se indica encima del eje x. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t bilateral, comparando las condiciones indicadas con el control no tratado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

medip#1 se enriqueció no solo en cultivos de animales him-5 (Fig. 4d), sino también en cultivos con números equivalentes de machos y hermafroditas (Fig. 4e), lo que confirma aún más que este compuesto está enriquecido en machos. La producción de medip#1 aumentó considerablemente en animales masculinizados fem-3(gf), pero fue indetectable en animales feminizados fem-2(lf) y glp-4 sin línea germinal, lo que indica que su producción está asociada con la presencia de una línea germinal masculina ( Figura 4f). De acuerdo con el origen de la línea germinal, la producción de medip#1 no cambió con respecto a los niveles de WT en hermafroditas Pnhx-2 :: fem-3 masculinizados intestinalmente (Figura complementaria 1b). medip#1 se produjo abundantemente en cultivos él-5 durante varios días después de alcanzar la etapa adulta, mientras que los cultivos hermafroditas WT produjeron cantidades modestas de este compuesto y solo de manera transitoria durante la etapa larvaria tardía/adulto joven (Fig. 4g).

La alimentación de metil-D3 metionina a C. elegans dio como resultado un marcado robusto D3 y D6 de medip#1–3 (Fig. 22 complementaria), lo que indica que la metilación del resto triptófano en estos dipéptidos se produce a través de una S-adenosilmetionina- ( Metiltransferasa dependiente de SAM. En particular, el aminoácido libre N, N-dimetiltriptófano (24), que detectamos en muestras de exo y endometaboloma de mutantes WT y him-5, permaneció sin marcar en el experimento de alimentación con D3-metionina (Figura complementaria 23). A diferencia del medip#1–3, también se detectó dimetiltriptófano en extractos de la bacteria E. coli OP50 utilizada como alimento, lo que sugiere que el dimetiltriptófano detectado es de origen bacteriano. Estos resultados sugieren que los medip#1–3 se derivan de la metilación de un péptido precursor en C. elegans, en lugar de una reacción de formación de péptidos que utiliza N,N-dimetiltriptófano. Finalmente, preguntamos si la abundancia de dipéptidos no metilados de triptófano con isoleucina o leucina también se ve afectada por la presencia o ausencia de una línea germinal masculina. No lo eran: estos dipéptidos eran igualmente abundantes en animales fem-3 (gf) (estos producen grandes cantidades de medip#1) y animales fem-2(lf) (medip#1 indetectable) como en los hermafroditas WT (Figura complementaria 1d). ).

A continuación, preguntamos si la producción enriquecida por machos de los metabolitos identificados en las secciones anteriores se conserva en otros nematodos. Un punto de referencia comúnmente utilizado para comparaciones con C. elegans es C. briggsae, un miembro del mismo género que también suele reproducirse mediante autofecundación. Al igual que C. elegans him-5, los cultivos de mutantes CBR-him-8 de C. briggsae producen un mayor número de machos48 (hasta un 30% en nuestras manos). La comparación de los exo y endo-metabolomas de los cultivos de C. briggsae CBR-him-8 y la cepa AF16 de C. briggsae WT reveló un número similar de características diferentes a las de nuestra comparación de C. elegans WT (N2) y CEL-him-. 5 metabolomas. Sin embargo, la mayoría de los metabolitos enriquecidos en machos que identificamos en C. elegans no pudieron detectarse o no estaban enriquecidos en machos de C. briggsae, lo que coincide con otros estudios recientes que demuestran que los metabolomas de los nematodos son altamente específicos de cada especie13. Las excepciones notables incluyen el nacq # 129 informado anteriormente, así como el dipéptido medip # 1 (26, Fig. 4h), que se enriqueció en el exometaboloma CBR-him-8 en un grado similar al de CEL-him-5.

Dado que se conserva la producción de medip#1 enriquecida en machos, seleccionamos este compuesto para una evaluación biológica adicional. medip#1 es mucho más abundante en los exo- que en los endo-metabolomas tanto en C. elegans como en C. briggsae, lo que indica que es excretado preferentemente por los machos y puede servir como una señal química, potencialmente provocando respuestas en los hermafroditas. Descubrimos que las larvas hermafroditas alcanzaron la edad adulta morfológicamente definida más rápido en placas acondicionadas con medip#1 sintético en concentraciones similares a las de las muestras de exometaboloma analizadas (Figura complementaria 24a). Esta aceleración se debe al acortamiento de la última etapa larvaria (L4) porque la progresión del desarrollo de las etapas larvarias anteriores no se ve afectada por el medip#1 (Figura complementaria 24b). El desarrollo más rápido de los tejidos somáticos estuvo acompañado por una maduración más rápida de la línea germinal oógena a medida que los hermafroditas expuestos a medip#1 adquirieron ovocitos más rápido (Fig. 4i) y comenzaron a ovular antes (Fig. 4j). El desarrollo del soma y de la línea germinal requiere mucha energía. Posiblemente para mantener la maduración sexual acelerada, medip#1 aumenta la tasa de consumo de alimentos (Fig. 4k). El resultado de la totalidad de los cambios fisiológicos inducidos por medip#1 en hermafroditas es el inicio más temprano de la reproducción (Fig. 4l), que puede conferir una ventaja competitiva en condiciones específicas durante los ciclos de auge y caída característicos de los entornos efímeros donde C. elegans habita14. Sin embargo, una maduración sexual más rápida parece producirse a costa de una vida adulta más corta. La exposición a concentraciones nanomolares de medip#1 reduce la vida útil hasta en un 12%, similar a los efectos de nacq#1 (Fig. 4m).

Dados los efectos fisiológicos de medip#1, preguntamos si los dipéptidos que están químicamente estrechamente relacionados con medip#1 tienen actividades similares. Para probar esto, seleccionamos triptófilo-isoleucina (Trp-Ile), correspondiente a un supuesto precursor no metilado de medip#1. Trp-Ile no aceleró el desarrollo, no indujo un inicio más temprano de la reproducción ni aumentó la tasa de bombeo faríngeo (Figuras complementarias 25a-d). Además, probamos el péptido inverso, isoleucil-triptófano (Ile-Trp) y un metabolito enriquecido en hombres químicamente no relacionado, bemeth#2, para detectar efectos sobre el inicio de la reproducción. Ni Ile-Trp ni bemeth#2 mostraron actividad alguna (Figuras complementarias 25d-f). Esta especificidad estructural de la actividad de medip#1 es similar al caso del nacq#1 descrito previamente, que también acelera el desarrollo, mientras que su isómero estructural estrechamente relacionado, nacq#2, está inactivo29. Por último, debido a que los efectos fisiológicos de medip#1 son en general similares a los del nacq#129 químicamente no relacionado, probamos si la aceleración del desarrollo por medip#1 y nacq#1 es aditiva o quizás sinérgica. Sin embargo, la combinación de medip#1 y nacq#1 no fue más efectiva que cualquiera de los compuestos solos en la concentración analizada (Figura complementaria 26). En conjunto, estos resultados indican que metabolitos específicos secretados por los hombres, incluidos medip#1 y nacq#1, regulan el desarrollo de los hermafroditas y el consumo de alimentos, mientras que los compuestos químicamente estrechamente relacionados presentes en el exometaboloma de C. elegans y otros metabolitos enriquecidos por los hombres sí lo hacen. no afecta estos fenotipos.

Nuestros análisis metabolómicos comparativos de machos y hermafroditas de C. elegans revelaron varios cientos de metabolitos significativamente enriquecidos en machos, para los cuales proporcionamos datos de MS y MS2 como base para futuros estudios hacia su caracterización bioquímica y funcional detallada. Es probable que este inventario aún esté en gran medida incompleto, ya que utilizamos límites estrictos de intensidad máxima para nuestro análisis que pueden haber excluido metabolitos menos abundantes o producidos de manera menos consistente. Además, las condiciones cromatográficas optimizadas específicamente para la detección de metabolitos muy polares y muy apolares (p. ej., lípidos) casi con seguridad revelarán compuestos adicionales con regulación positiva masculina. La caracterización química completa de una gran cantidad de metabolitos recientemente detectados presenta un desafío importante, ya que la elucidación de la estructura aún no se puede automatizar y aún depende de enfoques supervisados ​​uno por uno. Por lo tanto, para este estudio, seleccionamos miembros representativos y abundantes de varias familias de compuestos enriquecidos en hombres para una caracterización detallada, lo que descubrió una amplia gama de estructuras químicas inusuales que integran bloques de construcción de diversas vías metabólicas.

Nuestro análisis reveló que la producción de un subconjunto de metabolitos enriquecidos en hombres se correlacionaba con la presencia y la identidad sexual de la línea germinal (Fig. 5a). La biosíntesis de los dipéptidos medip#1–3 y los derivados acetilados de MTA acemta#1/2 se abolió en animales fem-2(lf) feminizados con línea germinal y glp-4 sin línea germinal y aumentó sustancialmente en fem-3( gf) animales. De acuerdo con el requisito de una línea germinal masculina para su producción, medip#1–3 y acemta#1/2 estuvieron ausentes en los gusanos en desarrollo hasta la maduración de la línea germinal durante la etapa de adulto joven. Varias familias adicionales de metabolitos enriquecidos en hombres que no se analizan en las secciones anteriores también se asociaron con la presencia de una línea germinal masculina. Esto incluye un marcado aumento en la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga, por ejemplo, ácido tetracosapentaenoico (30, figura complementaria 27), que puede derivarse de la marcada regulación positiva de dos elongasas de ácidos grasos, elo-4 y elo-. 7, en varones16. Metabolitos adicionales dependientes de la línea germinal masculina incluyen los derivados del ácido β-metildecanoico recientemente reportados, bemeth#2 (29) y bemeth#38, así como una serie de supuestos glucósidos modulares y otros compuestos cuyas estructuras aún no se han dilucidado (Datos complementarios 1 –3). La abundancia de compuestos dependientes de la línea germinal masculina que pudimos detectar en las muestras pequeñas seleccionadas a mano (p. ej., nacq#1 y medip#1) no cambió en los hermafroditas con el intestino masculinizado, lo que respalda aún más la idea de que el sexo de la línea germinal, más que la del soma, fue el determinante clave de su producción.

a Dependencia del soma y de la línea germinal de metabolitos seleccionados enriquecidos en hombres y hermafroditas. Reimpreso de la ref. 61 con permiso de Elsevier. b Estructuras químicas de los derivados de N,N-dimetiltriptamina y N,N-dimetiltriptófano de otros animales y plantas.

Por el contrario, la producción de varias otras familias de metabolitos enriquecidos en hombres no depende de la presencia de una línea germinal masculina. Por ejemplo, todos los glucósidos de ácido úrico enriquecidos en machos (p. ej., uglas#14 y uglas#104) todavía pueden detectarse en animales fem-2(lf) feminizados con línea germinal y glp-4 sin línea germinal. En particular, la producción de uglas#14 y uglas#104, que están más de diez veces enriquecidas en machos WT o him-5 en relación con los hermafroditas WT, solo aumentó ligeramente en animales hembra-3(gf) masculinizados con línea germinal y no difirió significativamente. entre animales fem-3(gf) y glp-4 sin línea germinal. Los animales fem-3 (gf) tienen un soma en gran medida hermafrodita, lo que indica que la regulación positiva de los metabolitos de la familia uglas # requiere un soma masculino (Fig. 5a). Nuestro hallazgo de que la masculinización del intestino hermafrodita es suficiente para masculinizar el perfil de los metabolitos de la familia uglas#, así como la proporción de los ascarósidos ascr#3 y ascr#10, indica que la especialización sexual de las vías metabólicas en el intestino es un factor clave. determinante para un subconjunto de características sexualmente dimórficas del metaboloma.

Un patrón distintivo de aparición se ejemplifica en la diversa familia de derivados de ascr#1 enriquecidos con him-5 (Fig. 3). Aunque la producción de estos compuestos aumentó dramáticamente en los exo o endometabolomas de cultivos de him-5 enriquecidos con machos, la mayoría no pudo detectarse en muestras de machos puros, excepto ascr#1, que no estaba regulado positivamente. Por lo tanto, se observaron niveles elevados de ascr#1 y de metabolitos modulares que incorporan ascr#1 (Fig. 3c) solo en cultivos que contenían machos y hermafroditas, pero no en muestras de machos WT puros o him-5, lo que sugiere que una mayor producción de Estos compuestos pueden resultar de interacciones entre los dos sexos (Fig. 5a).

Dadas sus estructuras elaboradas y su producción específica de cada sexo, parece probable que muchos de los metabolitos identificados cumplan funciones biológicas específicas, por ejemplo, como moléculas de señalización. Los compuestos excretados por machos en C. elegans previamente informados afectan aspectos del comportamiento22,24, la biología de la línea germinal26,27,28 y la tasa de desarrollo larvario27,29. Entre los metabolitos recientemente identificados seleccionamos el dipéptido medip#1 para estudio adicional, porque su producción enriquecida en machos se conserva en C. briggsae y porque se produce abundantemente de manera dependiente de la línea germinal masculina. Además, nos intrigó la similitud de su estructura química con la de otras biomoléculas potentemente activas, por ejemplo, dimetiltriptamina49,50 (31, Fig. 5b). Descubrimos que en concentraciones fisiológicamente relevantes, medip#1 acelera el desarrollo larvario de hermafroditas al acortar la duración de la última etapa larvaria. Otro compuesto enriquecido en machos, nacq#1, acelera de manera similar la última etapa larvaria29, lo que coincide con el hallazgo anterior de que muestras del exometaboloma masculino completo tienen el mismo efecto27. Los efectos de nacq#1 y medip#1, a pesar de sus estructuras químicas diferentes, parecen ser redundantes, ya que no observamos actividad aditiva o sinérgica. Queda por dilucidar si estos dos compuestos aceleran el desarrollo a través de un mecanismo compartido.

Tanto los efectos somáticos como los de la línea germinal de medip#1 promueven la estrategia reproductiva masculina de facilitar la maduración sexual de posibles parejas de apareamiento. Observaciones similares en otras especies, incluidos los mamíferos51, sugieren que esta puede ser una característica universal de la comunicación social en los animales. Curiosamente, recientemente se identificó un compuesto similar a un dipéptido, la β-alanil-triptamina (32, Fig. 5b), en el macho de Schistosoma mansoni y, como medip#1, se demostró que estimula el desarrollo femenino52. Al igual que la β-alanil-triptamina esquistosómica, el medip#1 podría derivarse de una péptido sintetasa no ribosómica (NRPS). Sin embargo, el genoma de C. elegans presenta solo un gen similar a NRPS, que se ha demostrado que está involucrado en la biosíntesis de un metabolito diferente53. Además, el hallazgo de que el dimetiltriptófano dietético no se incorpora al medip#1 puede sugerir un origen ribosómico. Se han descrito ciclopéptidos de probable origen ribosómico que incluyen dimetiltriptófano a partir de plantas, por ejemplo, waltherine (33)54. Por último, la abundante producción de medip#1 y la identificación del probable acemta#1/2 derivado de SAM pueden indicar diferencias específicas de sexo en el metabolismo de un carbono.

Nuestros resultados demuestran que la identidad masculina de la línea germinal y el soma puede regular la producción de distintos conjuntos de metabolitos. De manera similar, se puede esperar que la línea germinal hermafrodita y el soma contribuyan con metabolitos que no se producen, o solo en menor medida, en los machos, y los datos depositados con este estudio proporcionan un punto de partida para su análisis. Cabe señalar que la correlación de un metabolito con la presencia de la línea germinal masculina o femenina no necesariamente implica que la biosíntesis de ese metabolito se produzca, total o parcialmente, dentro de la propia línea germinal. Alternativamente, los metabolitos dependientes de la línea germinal pueden resultar de la activación o preparación de vías biosintéticas somáticas mediante señales de la línea germinal. La identificación de genes implicados en la biosíntesis de las diferentes familias de compuestos dependientes de la línea germinal será un siguiente paso importante hacia el descubrimiento de su origen tisular. En conjunto, nuestro trabajo destaca el poder de la metabolómica comparativa no dirigida en un sistema modelo genéticamente manejable para descifrar el papel del sexo y las contribuciones de señales de diferentes sistemas de órganos en la configuración de los metabolomas animales.

A menos que se indique lo contrario, los gusanos se mantuvieron a 20 °C en placas de Petri con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con E. coli OP50 obtenida del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)55. Las poblaciones se sincronizaron mediante tratamiento con hipoclorito alcalino de hermafroditas grávidas. Los huevos aislados se agitaron durante la noche en tampón M9 a 20 °C para producir larvas L1 sincronizadas y hambrientas56. Para los animales que eran sensibles al tratamiento con hipoclorito alcalino, los animales en etapa mixta se cultivaron a 15 °C y luego se lavaron la placa con 20 ml de tampón M9 que se recogió en tubos cónicos de 50 ml. Los tubos se dejaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual todas las etapas no L1 se asentaron en el fondo del tubo. Los 15 ml superiores, que contenían animales L1, se transfirieron a un tubo cónico nuevo, se enjuagaron dos veces con tampón M9 y luego se agitaron durante la noche en tampón M9 a una temperatura no permisiva (25 °C) antes de los experimentos. Se utilizaron las siguientes cepas para experimentos de metabolómica: Bristol N2 de tipo salvaje, CB4088 him-5(e1490), DH245 fem-2(b245), JK816 fem-3(q20) (ganancia de función), CB3844 fem-3 (e2006) (pérdida de función), SS104 glp-4(bn2), CB4037 glp-1(e2141), JK569 mog-3(q74) PS7922 cest-5.1(syb1131), FCS51 cest-5.1(syb1131); him-5(e1490), PHX3933 cest-5.1(syb1131);cest-5.2(syb3933), GR1395 mgIs49 [mlt-10::GFP-pest;ttx-1::GFP], UR936 fsEx445[Pnhx-2:: FEM-3(+)::SL2::mCherry::unc-54_3'UTR;Psulp-3::gfp].

Los animales se cultivaron a una densidad de tres gusanos/1 µL a las temperaturas indicadas en medio S-Complete suplementado con OP50 concentrado. Cuando los animales alcanzaron la edad adulta, los cultivos se establecieron como se describe anteriormente para separar a los adultos de cualquier descendencia. Los animales adultos se enjuagaron tres veces con M9 y una vez con agua para eliminar el OP50 residual y las sales. El sobrenadante que contenía larvas L1 se centrifugó a 1000 xg durante 1 min para eliminar las larvas L1 y el OP50 residual. Los gránulos de gusanos adultos y las muestras de medios condicionados se congelaron rápidamente y se almacenaron a -20 °C hasta su extracción.

Se colocaron cuatro animales N2 en placas NGM de 3,5 cm sembradas con OP50 y se cultivaron a 20 °C hasta la etapa L4. Luego, los gusanos se incubaron a 30 °C durante 5 h, luego volvieron a pasar a 20 °C y se les permitió reproducirse. Luego, los machos resultantes del choque térmico se colocaron en nuevas placas para aparearse con hermafroditas N2 y producir poblaciones de ~50% de machos.

Los animales en etapa mixta se cultivaron en placas NGM de 10 cm a 20 °C hasta que se agotó casi toda la comida, momento en el que los animales se enjuagaron de la placa con M9 y se asentaron como se describe anteriormente. Las larvas L1 aisladas se transfirieron a nuevas placas NGM de 10 cm sembradas con OP50. Los gusanos se cultivaron a 20 °C durante 72 h para producir una población sincronizada de adultos de 1 día de edad, que se recolectaron lavando la placa con M9. Los animales se centrifugaron a 1000 xg durante 1 min y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C. Los gusanos se enjuagaron dos veces con M9 y una vez con agua, luego se congelaron y almacenaron a -80 °C hasta su extracción.

Los animales N2 y him-5 se cultivaron en placas NGM de 10 cm sembradas con OP50 como se describió anteriormente. Después de 72 h, se seleccionaron 2000 hermafroditas N2, 2000 machos N2 y 2000 machos him-5 con un palillo para lombrices con punta de platino, se enjuagaron dos veces con M9 y una vez con agua, se granularon, congelaron y almacenaron a -80 °C hasta su extracción. .

En un período de 2 h, para animales UR936 WT y masculinizados intestinales, se seleccionaron manualmente 250 hermafroditas adultos del día 1 en 1 ml de tampón M9 que contenía OP50 (se seleccionaron individuos positivos para mCherry bajo un microscopio volumétrico fluorescente para la cepa masculinizada intestinal). UR936). Luego, el vial se agitó suavemente a 20 °C durante 5 h antes de que los animales se separaran del sobrenadante dejándolos asentarse en el fondo del vial. El sobrenadante transparente se transfirió a un vial vacío y el sedimento de lombriz residual y el sobrenadante se congelaron inmediatamente a -78 °C. Se recogieron un total de 20 viales (5000 animales) por genotipo. El tampón M9 elaborado a partir del mismo lote se utilizó como control en blanco en experimentos de cromatografía posteriores. Para preparar el tampón M9 que contiene OP50 mencionado anteriormente, se recogieron de 3 a 6 mg de E. coli OP50 del cultivo líquido fresco mediante centrífuga, se eliminó completamente el medio LB y se añadió tampón M9 como disolvente para resuspender las bacterias en 200 μl de tampón. por 1 mg de bacterias.

Aproximadamente 100.000 larvas L1 sincronizadas obtenidas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino (descrito anteriormente) se cultivaron a una concentración de 3 gusanos/1 µl en medio S-Complete suplementado con OP50 concentrado a 20 °C. Después de 38 h, cuando la mayoría de los gusanos estaban en el cuarto estadio larvario (L4), los cultivos se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml y se dejaron reposar durante 10 minutos, como se describió anteriormente. Los 25 ml superiores del medio de cultivo se transfirieron a un tubo cónico nuevo, se centrifugaron a 1000 xg durante 1 minuto y luego se congelaron rápidamente. Los animales se enjuagaron dos veces con tampón M9, una vez con tampón S-Complete y luego se resuspendieron a la misma concentración en medio S-Complete y se suplementaron con OP50. Se siguió el mismo protocolo y el medio condicionado se recogió nuevamente a las 52 h (gusanos en etapa de adulto joven), a las 72 h (etapa de adulto grávido), a las 96 h (adultos del día 1), a las 120 h (adultos del día 2), y 144 h (día 3 adultos). El protocolo de asentamiento fue esencial para separar las larvas recién nacidas de los adultos envejecidos; Muchas larvas estuvieron presentes en el cultivo a partir del punto de tiempo de 72 h. En la cosecha final, los adultos envejecidos se granularon, se enjuagaron tres veces con tampón M9 y una vez con agua, y luego se congelaron rápidamente. El perfil de desarrollo de los cultivos him-5(e1490) se realizó utilizando el mismo protocolo pero ampliado por 2 días. El medio condicionado se recogió a las 38, 52, 72, 96, 120, 144, 168 y 192 h después de que comenzó el experimento, y los adultos de edad avanzada se recogieron al final como se describe.

Se sincronizaron los animales N2 y él-5 L1, y se cultivaron 100.000 animales en S-Complete a 25 °C como se describe anteriormente. Después de 56 h, se sedimentó el cultivo, el sedimento se enjuagó tres veces con M9 y una vez con agua, el sobrenadante se centrifugó para eliminar L1 y OP50, y tanto el sedimento como el sobrenadante se congelaron a -80 °C.

Se prepararon larvas sincronizadas de him-5(e1490) L1 mediante tratamiento con hipoclorito alcalino como se describe, y se cultivaron cinco cultivos separados de 70.000 animales cada uno en medio S-Complete suplementado con OP50 concentrado. Los cultivos se cultivaron sin adición o se complementaron con l-metionina (Sigma-Aldrich M9625) o 1-D3-metil-metionina (Cambridge Isotope Laboratories DLM-431) para lograr una concentración final de 10 mM. Se realizaron dos experimentos de marcaje isotópico en los que los animales recibieron suplementos comenzando en la etapa L4 (después de 48 h en cultivo) o al comienzo del experimento.

Se liofilizaron gránulos de lombrices congelados (endometaboloma) y medios acondicionados (exometaboloma), y los gránulos se homogeneizaron con un triturador de tejidos. Los medios y los sedimentos se extrajeron en 30 ml y 13 ml de metanol puro, respectivamente, durante 16 h con agitación. Los extractos de metanol se separaron del material insoluble mediante centrifugación, se secaron al vacío y se resuspendieron en 50 µl de metanol para cultivos en placas y 150 µl de metanol para cultivos líquidos.

Los sedimentos congelados se liofilizaron y homogeneizaron como anteriormente, luego se extrajeron con 12 ml de una mezcla de acetato de etilo:etanol 9:1 durante 16 h con agitación. Los extractos orgánicos se trataron como los extractos de metanol anteriores y se resuspendieron en 150 µl de etanol para su análisis mediante HPLC-MS.

La cromatografía líquida se realizó utilizando un Vanquish Horizon UHPLC controlado por el software Chromeleon (ThermoFisher Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas de alta resolución Orbitrap Q-Exactive HF controlado por el software Xcalibur (ThermoFisher Scientific) o un Dionex Ultimate 3000 UHPLC acoplado a un Orbitrap Q- Espectrómetro de masas exactivo de alta resolución controlado por el mismo software. La separación por UHPLC se logró utilizando una columna Thermo Hypersil GOLD C18 (tamaño de partícula de 2,1 × 150 mm y 1,9 µm) mantenida a 40 °C. Disolvente A: 0,1% de ácido fórmico en agua; Disolvente B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente A/B comenzó con 1% de B durante 3 minutos después de la inyección y aumentó linealmente hasta 98% de B a los 20 minutos, seguido de 5 minutos con 98% de B, luego volvió a 1% de B durante 0,1 minutos y finalmente se mantuvo en 1% de B. durante 2,9 min adicionales.

Para los extractos de lípidos, se realizó una cromatografía de emparejamiento iónico posterior a la columna de fase inversa utilizando un UHPLC Vanquish Horizon acoplado a un Orbitrap Q-Exactive HF como se indicó anteriormente. Disolvente A: 0,1% de acetato de amonio en agua; disolvente B: acetonitrilo. El gradiente A/B comenzó con 5 % de B durante 3 min después de la inyección y aumentó linealmente hasta 98 ​​% de B a los 20 min, seguido de 5 min con 98 % de B, luego volvió a 5 % de B durante 0,1 min y finalmente se mantuvo en 5 % de B. durante 2,9 min adicionales. Una segunda bomba (Dionex 3000) que controlaba una solución de amoníaco 800 mM en metanol se hizo funcionar a un caudal constante de 0,015 ml/min durante la duración del método y se mezcló a través de una válvula microdivisora ​​(Idex #P-460S) con la línea de eluido de la columna.

Parámetros del espectrómetro de masas: voltaje de pulverización (−3,0 kV, +3,5 kV), temperatura del capilar 380 °C, temperatura del calentador de la sonda 400 °C; Gas de vaina, auxiliar y de barrido 60, 20 y 2 AU, respectivamente. Nivel de RF de la lente S: 50, resolución 120.000 a m/z 200, objetivo AGC 3E6. Cada muestra se analizó en modos de ionización por electropulverización negativo y positivo. Parámetros para MS/MS (dd-MS2): Resolución MS1: 60.000, Objetivo AGC: 1E6. Resolución MS/MS: 30.000, Objetivo AGC: 2E5, tiempo máximo de inyección: 50 ms, ventana de aislamiento 1,0 m/z, energía de colisión normalizada escalonada (NCE) 10, 30; exclusión dinámica: 5 s, 10 masas principales seleccionadas para MS/MS por escaneo.

Los datos de UHPLC-HRMS se analizaron utilizando el software Metaboseek después de la conversión del archivo al formato mzXML mediante MSConvert (v3.0, ProteoWizard)1,2. Se detectaron un total de 41.795 funciones en ESI- y 68.389 funciones en ESI+. No se realizó ninguna coincidencia de características (ESI + con ESI-) en esta etapa, y todas las características, incluidos isótopos, aductos y fragmentos, se conservaron para el análisis comparativo posterior en Metaboseek. Para la posterior priorización de características, se utilizaron los siguientes criterios de filtración: (i) un aumento mínimo del doble en la tensión de interés sobre el control (es decir, him-5 sobre N2), (ii) una intensidad promedio mínima de 100.000 unidades arbitrarias para la característica en la cepa de interés, y (iii) un valor de P inferior a 0,05 calculado mediante la prueba t no apareada de dos caras. La conexión en red MS2 se realizó en MetaboSeek (versión 0.9.7). Las características se combinaron con su respectivo escaneo MS2 dentro de una ventana m/z de 5 ppm y una ventana de tiempo de retención de 15 s, utilizando la función MS2scans. Para construir una red molecular, la tolerancia de los picos de los fragmentos se estableció en una m/z de 5 ppm, el número mínimo de picos se estableció en 3 y el nivel de ruido se estableció en 2%. Una vez construida la red, se utilizó un valor de coseno de 0,6 y el número de conexiones posibles se limitó a 10. Las fórmulas moleculares se determinaron tras un análisis comparativo mediante redes Metaboseek y MS2, utilizando las herramientas de predicción MF integradas de Thermo Xcalibur y Chemcalc (https://www.chemcalc.org/).

Para los compuestos analizados, el área bajo la curva (AUC) del compuesto de interés se obtuvo manualmente mediante la integración en Thermo FreeStyle y Qual Browser. La normalización al tipo salvaje (N2) se logró dividiendo el AUC del compuesto de interés por el AUC de ascr#3, como se detectó en el exometaboloma en la ionización ESI. Los valores de P para los datos de metabolómica se calcularon mediante pruebas t no apareadas con corrección de Welch.

Se generó una curva de concentración para medip#1 preparando una serie de diluciones de medip#1 sintético (35,7 nM, 357 nM, 3,57 µM), que posteriormente se analizaron mediante análisis ESI + MS junto con muestras endometabolómicas WT de C. elegans. . El área bajo la curva para medip#1 (m/z = 346,21251) se determinó utilizando el software Fisher Scientific Freestyle. Las concentraciones en las muestras de exometaboloma de cultivo líquido de WT (hermafroditas) y him-5 (~30% hombres) analizadas (volumen 150 µL, consulte "Procedimientos de extracción" más arriba) se determinaron como ~300–500 nM (WT, etapa de adulto joven) y ~1,6–2 µM (him-5, adultos del día 1), correspondientes a concentraciones en los cultivos líquidos originales (volumen 25 ml) de aproximadamente 2–3 nM (WT) y 10–12 nM (him-5), respectivamente. Es probable que estas estimaciones estén por debajo de las concentraciones reales debido a la pérdida de algunos compuestos durante la extracción.

Las placas se acondicionaron como se describe en este párrafo, excepto las placas utilizadas en ensayos de envejecimiento y el ensayo que mide el momento de la primera puesta de huevos, que se describen por separado en secciones posteriores. El medip#1 concentrado se almacenó en etanol a -20 °C. Las diluciones se hicieron en etanol. Para la mayoría de los tratamientos, se añadió una solución de medip#1 2 μM a un volumen igual de dilución 1:10 de cultivo nocturno de OP50, de modo que se pipeteó medip#1 1 μM en un volumen total de 20 μl en una placa de 6 cm. Esto se absorbió rápidamente en la placa y se pipeteó una segunda gota de 20 µl de OP50 en dilución 1:10 sobre la primera gota. Se espera que la difusión durante la noche del compuesto añadido por todo el volumen total de agar en las placas (10 ml) produzca una concentración de ensayo final de ~2 nM. Para experimentos que probaron medip#1 en diferentes concentraciones, la solución madre se ajustó en consecuencia para producir la concentración final deseada. El acondicionamiento de placas con otros compuestos se realizó de manera análoga. Las placas de control se prepararon con etanol solo añadido a bacterias OP50 como anteriormente. Estas placas se incubaron durante la noche a 20 °C y se utilizaron al día siguiente.

La aceleración para alcanzar la morfología del desarrollo adulto (Fig. 24 complementaria) se determinó utilizando el protocolo descrito en la ref. 27. Brevemente, después de la sincronización mediante tratamiento con hipoclorito, se seleccionaron 25 larvas L1 en placas de control y se seleccionaron 25 larvas L1 en placas preparadas con medip#1 2 nM como anteriormente. A partir de las 48 h posteriores a la liberación de la detención de L1, se monitoreó a los gusanos cada 2 h para determinar la transición de L4 a adulto joven. La estadificación del desarrollo se basó en la morfología vulvar y gonadal57. Estos resultados se utilizaron para calcular la diferencia en el tiempo de desarrollo cuando la mitad de la población había alcanzado la edad adulta entre los gusanos expuestos a medip#1 2 nM y sus controles emparejados.

Se realizó un censo de ovocitos en la gónada y de embriones en el útero mediante un protocolo establecido58. Se pipetearon aproximadamente 30 larvas L1 sincronizadas preparadas mediante tratamiento con hipoclorito alcalino en placas de NGM de control o en placas de NGM preparadas con medip#1 2 nM, como se describió anteriormente. Cada 2 h, a partir de las 48 h de liberación posterior a la detención de L1, se examinaron 25 gusanos de cada condición en un microscopio compuesto Leica DM5000B. Se contó el número de ovocitos que abarcaban completamente la gónada en los brazos anterior y posterior, así como el número de embriones fertilizados en el útero. Además, se anotó la fracción de gusanos que habían ovulado al menos una vez.

Los hermafroditas N2 se sincronizaron mediante tratamiento con hipoclorito alcalino y se criaron en placas NGM de control durante 72 h. En ese momento, se transfirieron diez hermafroditas a placas NGM de control o a placas medip#1 2 nM preparadas como anteriormente, y luego se dejaron aclimatar durante una hora. Después de la aclimatación, se monitorizó a los animales individualmente y se contó el número de bombas faríngeas que ocurrían en 20 s. Esto se hizo tres veces para cada individuo, esperando al menos 20 s entre conteos. Se midieron las velocidades de bombeo faríngeo de 30 gusanos para medip#1 2 nM y control.

Las curvas de muda se generaron utilizando el protocolo descrito en la ref. 59, excepto que el tiempo del experimento se limitó a 22 a 36 h después de la liberación del arresto de L1, cubriendo las etapas larvales de L1 a L3. El experimento se basó en monitorear el nivel de GFP en GR1395 mgIs49 [mlt-10::GFP-pest; ttx-1::GFP] larvas hermafroditas60. Los gusanos se mantuvieron a 20 °C en OP50 E. coli en condiciones estándar de crecimiento de nematodos55. Las poblaciones se sincronizaron mediante tratamiento con hipoclorito alcalino de hermafroditas grávidas. Se permitió que los huevos aislados eclosionaran durante la noche en tampón M9 con rotación a 20 °C56. Se transfirieron entre 50 y 60 larvas L1 de esta población a placas de control o a placas medip#1 2 nM. Cada uno de los dos experimentos consistió en seis placas de control y seis de tratamiento, para un total de 678 hermafroditas (342 controles y 336 medip#1 2 nM). El experimentador no conocía la identidad de las placas. Los animales fueron examinados cada hora y puntuados según la fluorescencia de GFP en un estereomicroscopio Leica MZ16F.

A adultos fértiles sincronizados (60 animales) se les permitió poner huevos durante 2 h en placas NGM de 6 cm recubiertas con bacterias OP50 E. coli. Los huevos individuales resultantes (ISO = condición aislada) o 40 huevos por placa (HD = condición de alta densidad) se transfirieron a placas NGM de 3,5 cm (volumen: 4 ml de agar) que se habían preparado de la siguiente manera: Para ensayos con nacq#1 o medip#1, 100 µL de soluciones madre acuosas de medip#1 (400 µM, 40 µM, 4 µM, 400 nM o 40 nM) y nacq#1 (40 nM, 4 nM, 400 pM o 40 pM) se distribuyeron sobre la superficie de la placa, dando como resultado placas que contenían 10 µM, 1 µM, 100 nM, 10 nM o 1 nM de medip#1, placas que contenían 1 nM, 100 pM, 10 pM o 1 pM de nacq#1, así como placas tratadas simuladamente (control). De manera análoga, se prepararon de manera análoga placas que contenían medip#1 10 nM más nacq#1 10 pM, así como placas que contenían 100 nM o 10 nM de Trp-Ile o Ile-Trp. Las placas se secaron durante 20 minutos con las tapas abiertas en una campana extractora. Luego se colocaron en el centro de cada placa 30 µl de bacterias E. coli cultivadas durante la noche en solución LB. Las placas se secaron durante 20 minutos y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente antes de su uso. Como hora de inicio del ensayo, se definió el momento de la transferencia de óvulos. A las 59 h a 20 ° C, se transfirieron de 7 a 15 gusanos individuales cultivados en condiciones ISO y HD en placas compuestas o tratadas de forma simulada a placas compuestas o tratadas de forma simulada. A las 60 h y luego cada hora, se puntuó la puesta de huevos de las lombrices. Los animales se calificaron utilizando un microscopio Leica DM 5500B.

A adultos fértiles sincronizados (60 animales) se les permitió poner huevos durante 2 h en placas NGM de 6 cm sembradas con bacterias OP50 E. coli. Posteriormente, los huevos se transfirieron a placas NGM de 3,5 cm (20 huevos por placa, volumen de placa de 4 ml) que se trataron de la siguiente manera: 100 µl de soluciones madre acuosas de medip#1 (400 µM, 40 µM, 4 µM o 400 µM). nM) o control de disolvente (etanol al 0,1 % en el volumen añadido de 100 µl) se distribuyeron sobre la superficie de la placa, lo que dio como resultado placas que contenían 10 µM, 1 µM, 100 nM o 10 nM de medip#1, y placas tratadas de forma simulada. (control). Las placas se secaron durante 20 minutos bajo una campana extractora. Se colocaron en el centro de cada placa 30 µl de bacterias E. coli cultivadas durante la noche en solución LB. Las placas se secaron durante 20 minutos y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente antes de usarlas en el experimento. A partir del día 3, las lombrices se transfirieron a placas experimentales frescas diariamente, después de 8 días, cuando los animales dejaron de poner huevos, se transfirieron cada 3 días a placas frescas. Se controló diariamente la supervivencia de los gusanos y se retiraron los animales muertos. Los animales se calificaron utilizando un microscopio Leica DM 5500B.

Los datos de LC-MS se recopilaron utilizando el software Thermo Scientific Xcalibur versión 4.1.31.9. Los datos de LC-MS se analizaron utilizando la versión 0.9.7 del software Metaboseek y la cuantificación se realizó mediante integración en Excalibur Quan Browser versión 4.1.31.9. Los espectros de RMN se procesaron y se corrigieron los valores iniciales utilizando los paquetes de software MestreLabs MNOVA versión 11.0.0-17609. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism (versiones 9.2 y 9.4.1), Metaboseek (versión 0.9.7) o R (versión 4.1.1). Los valores de P de los conjuntos de datos se determinaron mediante pruebas t de Welch de dos colas, a menos que se especifique lo contrario. Las barras de error representan errores estándar de la media (SEM).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de MS y MS/MS están disponibles en GNPS/MassIVE con el código de acceso MSV000089965. Consulte MS Data Inventory (Datos complementarios 4) para obtener nombres de archivos e identidades de muestra. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación fue apoyada en parte por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM131877 y U2CES030167 para FCS, y NIH R01 GM140415 para DSP) y el Instituto Médico Howard Hughes (beca académica para FCS). EZA e IR fueron financiados en parte por una subvención de NSF (IOS-1755244) para IR. Algunas cepas utilizadas en este trabajo fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Agradecemos a Gary Horvath por el apoyo técnico y a Ivan Keresztes y David Kiemle por su ayuda con la espectroscopia de RMN.

Alexander B. Artyukhin

Dirección actual: Departamento de Química, Facultad de Ciencias Ambientales y Silvicultura, Universidad Estatal de Nueva York, Syracuse, NY, 13210, EE. UU.

Jintao Luo

Dirección actual: Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Xiamen, 361102, Xiamen, Fujian, China

Instituto Boyce Thompson y Departamento de Química y Biología Química, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Russell N. Burkhardt, Alexander B. Artyukhin, Brian J. Curtis, Bennett W. Fox, Andreas H. Ludewig, Diana Fajardo Palomino, Oishika Panda, Chester JJ Wrobel, Victor Baumann y Frank C. Schroeder

Departamento de Biociencias Moleculares, Universidad Northwestern, Evanston, IL, 60208, EE. UU.

Erin Z. Aprison e Ilya Ruvinsky

Departamento de Genética Biomédica, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Jintao Luo y Douglas S. Portman

Departamento de Biología Molecular y Genética, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Amaresh Chaturbedi y Siu Sylvia Lee

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FCS e IR supervisaron el estudio. RNB, ABA, BWF, SSL, IR, DSP y FCS diseñaron el estudio. RNB, ABA, EZA, BWF, BJC, AHL, OP, CJW, JL, DFP, VB y AC realizaron experimentos químicos y biológicos. RNB, IR y FCS escribieron el artículo con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Ilya Ruvinsky o Frank C. Schroeder.

FCS es cofundador de Ascribe Bioscience Inc. y de Holoclara Inc. Los autores restantes no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a James Collins y Michael Witting por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Burkhardt, RN, Artyukhin, AB, Aprison, EZ et al. Especificidad sexual del metaboloma de C. elegans. Nat Comuna 14, 320 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36040-y

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Recibido: 23 de julio de 2022

Aceptado: 13 de enero de 2023

Publicado: 19 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36040-y

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Biología química de la naturaleza (2023)

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