Preparación de grandes muestras biológicas para alta

Nature Protocols volumen 18, páginas 1441–1461 (2023)Cite este artículo

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Las imágenes en diferentes escalas son esenciales para comprender la morfología de los órganos sanos y los cambios fisiopatológicos. La morfología tridimensional a macro y microescala de muestras grandes, incluidos órganos humanos intactos, es posible con microtomografía de rayos X (utilizando fuentes de laboratorio o sincrotrón). Sin embargo, la preparación de muestras grandes para imágenes de alta resolución es un desafío debido a limitaciones como la contracción de la muestra, el contraste insuficiente, el movimiento de la muestra y la formación de burbujas durante el montaje o el escaneo. Aquí, describimos la preparación, estabilización, deshidratación y montaje de grandes muestras de tejidos blandos para microtomografía de rayos X. Detallamos el protocolo aplicado a órganos humanos completos y la tomografía de contraste de fase jerárquica en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón, pero es aplicable a una variedad de muestras biológicas, incluidos organismos completos. El protocolo mejora el contraste cuando se utilizan imágenes de rayos X, al tiempo que evita el movimiento de la muestra durante la exploración, incluso con diferentes orientaciones de la muestra. Las burbujas atrapadas durante el montaje y las formadas durante el escaneo (en el caso de imágenes de rayos X sincrotrón) se mitigan mediante múltiples pasos de desgasificación. La preparación de muestras también es compatible con resonancia magnética, tomografía computarizada y observación histológica. La preparación y el montaje de la muestra requieren entre 24 y 36 días para un órgano grande, como un cerebro o un corazón humano completo. El tiempo de preparación varía dependiendo de la composición, tamaño y fragilidad del tejido. El uso del protocolo permite escanear órganos intactos con un diámetro de 150 mm con un tamaño de vóxel local de 1 μm. El protocolo requiere usuarios con experiencia en el manejo de órganos humanos o animales, operación de laboratorio e imágenes de rayos X.

La cuantificación de la morfología de los órganos humanos, tanto en la salud como en la enfermedad, es una tarea compleja que puede abordarse mediante modalidades de imágenes espaciales multimodales, capaces de abarcar escalas dimensionales. La caracterización morfológica completa del tejido requiere la detección de interacciones entre escalas; sin embargo, la mayoría de las técnicas de obtención de imágenes están limitadas por la resolución o el campo de visión, lo que dificulta unir observaciones y datos macroscópicos con microscópicos. Los enfoques convencionales de histología1,2,3 o microscopía electrónica4,5,6 permiten visualizar la organización y composición microestructural del tejido a través de secciones seriadas, y los datos pueden cuantificarse adecuadamente; sin embargo, estos enfoques normalmente requieren muestreo y corte del tejido y requieren mucha mano de obra y mucho tiempo. La limpieza óptica combinada con la microscopía de lámina luminosa puede proporcionar un gran campo de visión con alta resolución; sin embargo, la limpieza del tejido también requiere grandes plazos y suele ser costosa; Además, la profundidad de la imagen para un microscopio de lámina luminosa está limitada por la distancia de trabajo de la lente del objetivo7,8. Incluso cuando se han eliminado órganos humanos adultos8 o animales enteros9 durante un período de varios meses, obtener imágenes de ellos sigue siendo un desafío. Inconvenientes similares se aplican a la tomografía de coherencia óptica10,11, la microscopía multifotónica12 o la microscopía confocal13,14, que pueden capturar la microestructura tridimensional (3D) local del tejido a escala celular, pero tienen una penetración tisular limitada, lo que dificulta la obtención de imágenes de tejido profundo15. Recientemente, las imágenes por resonancia magnética (IRM) de alta resolución alcanzaron un tamaño de vóxel isotrópico de 100 µm en un cerebro humano completo ex vivo16. Aunque la resonancia magnética no es destructiva y tiene un gran campo de visión17, la resolución aún no es suficiente para examinar la microestructura del tejido. Las técnicas de imágenes jerárquicas son capaces de superar el equilibrio entre resolución y campo de visión. En un enfoque jerárquico, se adquieren múltiples imágenes de la misma muestra con diferentes resoluciones para unir las diferentes escalas. Se ha utilizado la tomografía microcomputada (μCT) para obtener imágenes de pulmones completos con una resolución de vóxeles de 150 μm, seguida de la posterior extracción de núcleos de biopsia en los pulmones; Estos pequeños núcleos luego se escanearon con µCT para lograr vóxeles de 10 µm18.

Durante la última década se han logrado avances considerables en el campo de las imágenes de rayos X, especialmente para la visualización de tejidos blandos19. La tomografía computarizada por rayos X sincrotrón (CTs) ha demostrado ser una de las técnicas de imagen basadas en rayos X más potentes debido a su alto brillo20, permitiendo la observación de tejidos blandos a alta resolución, con suficiente contraste para detectar componentes microestructurales21, como como neuronas individuales22 o fibras de elastina23. En particular, la sCT24 basada en contraste de fase, combinada con procedimientos optimizados de preparación y montaje de muestras, ha proporcionado amplia información sobre la orientación de las fibras cardíacas25,26 y, por separado, de los mapas celulares del cerebro27. Las imágenes de contraste de fase se refieren a la detección de cambios de fase de un haz de rayos X impartido por una muestra28. Esta técnica permite la visualización de tejidos blandos que serían indetectables con la tomografía radiológica convencional en ausencia de un agente de contraste29. Sin embargo, los estudios que utilizan sCT se limitan principalmente a órganos fetales30, pequeñas submuestras de órganos humanos adultos31 u órganos de modelos de animales pequeños, por ejemplo, ratón32 y conejo33, debido al campo de visión restringido. Algunos estudios han demostrado la obtención de imágenes de muestras más grandes, como celacantos con un diámetro que alcanza los 10 cm y una altura de 30 cm34,35; sin embargo, el tamaño del vóxel estaba limitado a 30 µm y la estructura de interés eran tejidos duros o cartílagos.

Las fuentes de sincrotrón de cuarta generación, como la Fuente Extremadamente Brillante de la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF), proporcionan suficiente coherencia y flujo espacial del haz para visualizar órganos humanos intactos desde la macroescala hasta la microescala. Utilizando la fuente extremadamente brillante del ESRF, hemos desarrollado recientemente una técnica denominada tomografía de contraste de fase jerárquica36 (HiP-CT) que permite escanear grandes órganos humanos intactos con vóxeles isotrópicos de ~20 µm, con un zoom posterior (sin seccionar), logrando hasta a vóxeles isotrópicos de 1 μm localmente. Aunque a menudo se pasa por alto, la preparación y el montaje de las muestras son cruciales para lograr las resoluciones más altas con esta y otras técnicas, especialmente cuando se visualizan grandes muestras de tejido blando, como órganos humanos, donde la relación entre el tamaño del vóxel y el diámetro del órgano es 1:150.000 (1 µm). en 150 milímetros). El diámetro máximo de imagen está limitado por el equipo y los parámetros de configuración de la línea de luz, como el ancho del haz de rayos X, el tamaño del detector, la potencia informática disponible para reconstruir los datos y el tamaño de los datos. Actualmente, el diámetro máximo del órgano del que hemos obtenido imágenes es de 150 mm, pero la configuración actual sería compatible con hasta 250 mm de diámetro por 500 mm verticalmente.

El éxito de todas estas técnicas experimentales depende de la cuidadosa preparación de la muestra para evitar artefactos de imagen. Las imágenes de tejidos blandos mediante µCT o sCT presentan una serie de desafíos en comparación con los tejidos duros. Uno de estos problemas es la falta de contraste cuando se obtienen imágenes con rayos X debido a las densidades similares de los componentes de la muestra. Además, los algoritmos de retroproyección que se utilizan normalmente para reconstruir el volumen 3D a partir de proyecciones de rayos X suponen que la muestra no se mueve durante el escaneo. La mayoría de los métodos de preparación de muestras están diseñados para evitar la deriva o la deformación de la muestra, para evitar artefactos de movimiento que reducirían la calidad de las imágenes37. Se han desarrollado algunos algoritmos de reconstrucción, como la compensación de movimiento38,39 o los basados ​​en aprendizaje automático40,41, para superar este problema42, pero su funcionamiento sigue siendo complejo y costoso desde el punto de vista computacional19.

Aunque el protocolo que describimos es aplicable a una amplia gama de muestras biológicas de diferentes tamaños y que utilizan una variedad de modalidades de imágenes, aquí nos centramos en las muestras que se van a tomar mediante imágenes de contraste de fase sincrotrón. El método también es aplicable a otras modalidades de imágenes; sin embargo, es posible que sea necesario optimizar el procedimiento según el tamaño de la muestra y la modalidad elegida (consulte los pasos del protocolo para conocer posibles recomendaciones de optimización).

El protocolo de preparación y montaje de muestras descrito en este documento se desarrolló a partir de la necesidad de obtener imágenes de grandes volúmenes biológicos, como pulmón, cerebro, corazón, riñón y bazo humanos intactos. La técnica permite escanear órganos completos con un tamaño de vóxel isotrópico de 25 µm. Luego se seleccionan las áreas para realizar exploraciones adicionales de alta resolución sin necesidad de biopsias. Para obtener imágenes de estructuras tan grandes, se requiere un haz de rayos X de alta energía para penetrar las muestras. Utilizamos un haz policromático con energía que oscila entre 64 y 120 keV para obtener imágenes de órganos, pero energías más altas (hasta 140 keV) serían óptimas, si estuvieran disponibles.

La preparación y estabilización del órgano para esta técnica es esencial ya que cualquier falta de homogeneidad en la densidad, burbujas de gas o movimiento durante el escaneo reducirían en gran medida la calidad de la imagen. Durante el desarrollo del método, surgieron varios desafíos, como se describe en la figura 1 de datos ampliados. El atrapamiento de burbujas (durante el montaje) y la formación de burbujas (durante el escaneo) crean artefactos borrosos por movimiento y contraste de fase, y reducen la calidad del escaneo. Esto se resolvió limitando la dosis absorbida por la muestra e incluyendo múltiples pasos de desgasificación durante el procedimiento de preparación y montaje del órgano. El movimiento de la muestra durante el escaneo es un desafío adicional, particularmente porque las muestras son grandes y, por lo tanto, a menudo requieren mucho tiempo (>5 h) para obtener imágenes. Este desafío se resolvió empaquetando cuidadosamente una mezcla de gel de agar triturado y líquido (en nuestro caso, etanol al 70%) como medio de montaje alrededor del órgano. Además, la deshidratación del órgano con etanol aumentó el contraste de las imágenes43 y disminuyó la formación de burbujas.

Aquí, presentamos un procedimiento para preparar órganos humanos completos para imágenes con sCT, µCT, CT médica y MRI que es compatible con una etapa final de histología clásica incluida en parafina. En este protocolo, describimos principalmente la preparación de la muestra y el montaje con etanol-agar; el protocolo de imágenes de rayos X utilizando HiP-CT y su aplicación a una aplicación médica (cuantificando el daño que la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causa a la vasculatura pulmonar)44,45. En resumen, después de la fijación del cuerpo (Paso 1A(i)), los órganos se extraen (Paso 1A(ii-iii)), se fijan por inmersión (Paso 2), se deshidratan y desgasifican con vacío (Paso 4A) o ciclos térmicos (Paso 4B) dependiendo de su fragilidad, montado con una mezcla de gel de agar triturado (Pasos 5 a 33) y fotografiado mediante sCT (Pasos 34 a 54), µCT (Paso 55), CT clínica (Paso 55) y MRI (Paso 55), y finalmente, se realiza el análisis histológico (Paso 56). Para obtener una descripción general del procedimiento, consulte la Fig. 1.

El protocolo contiene tres pasos principales (adquisición y preparación de órganos, montaje de órganos e imágenes) indicados en cuadros codificados por colores. El órgano puede recuperarse de un biobanco, de una cirugía, de un trasplante descartado o puede extraerse de un cuerpo donado. Proporcionamos dos protocolos de desgasificación en función de la fragilidad del órgano (desgasificación al vacío y desgasificación por ciclos térmicos). Una vez montada la muestra con el gel de agar, se pueden realizar diferentes técnicas de imagen (μCT, sCT, CT clínica y MRI). Después de la obtención de imágenes, se puede realizar histología en la muestra.

Este protocolo fue desarrollado y optimizado para la preparación de órganos humanos completos para obtener imágenes de alta resolución con HiP-CT, como se muestra en la Fig. 2, y se ha aplicado a varios órganos, incluidos el cerebro, el corazón, los pulmones, los riñones y el bazo. Sin embargo, el procedimiento de preparación de órganos es flexible y puede utilizarse con tejidos blandos de origen animal o incluso con animales pequeños intactos. En la figura 3 de datos ampliados se proporciona una lista de órganos humanos y muestras biológicas obtenidas con este método y el tiempo de preparación de cada paso. Los métodos de preparación de muestras más comunes para imágenes de rayos X incluyen fijación, deshidratación alcohólica, inclusión en parafina o punto crítico. el secado. Uno de los principales inconvenientes de la inclusión húmeda, como la inmersión alcohólica, es la deriva de la muestra, que crea artefactos de movimiento37. La inclusión en parafina y el secado en puntos críticos modifican la estructura de la muestra para aumentar su rigidez, lo que permite que la muestra permanezca inmóvil durante un largo período de tiempo.

a, vista 3D del corazón humano obtenida con la línea de luz BM05 en ESRF. b – d, Secciones transversales del corazón con un tamaño de vóxel isotrópico de 25 µm (b), 6,5 µm (c) y 2,5 µm (d). e, Ampliación de la imagen de 2,5 vóxeles con anotación sobre las principales estructuras observadas (ca, arteria coronaria; mc, células de miocitos; ad, tejido adiposo). Toda la información básica sobre el paciente del que se origina este órgano se proporciona en la Figura 2 de Datos ampliados. Todos los experimentos siguieron las regulaciones éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos en humanos.

En este protocolo, el movimiento de la muestra se evita mediante el uso de pequeños bloques de gel de agar y gel de agar triturado en equilibrio de densidad con el líquido de montaje, manteniendo la muestra en su lugar. Las exploraciones realizadas con varios meses de diferencia en la misma muestra preparada con nuestro protocolo de estabilización de órganos se pueden registrar simplemente mediante una transformación rígida manual. Esto demuestra la estabilidad de este método durante largos períodos de tiempo. Un problema común a todos estos métodos de preparación de muestras es la contracción del tejido. Este efecto puede dificultar la cuantificación morfológica y dar lugar a análisis erróneos. Sin embargo, en comparación con la inclusión en parafina46,47 y el secado en el punto crítico37,48, la contracción de la muestra en este protocolo se puede mitigar utilizando múltiples baños de etanol en concentraciones ascendentes de etanol43 hasta el 70%, preservando así la morfología del tejido. Además, la deshidratación de la muestra con etanol asegura un mayor contraste con µCT43,49 o sCT50. Este protocolo de preparación de muestras es compatible con muchas técnicas de resonancia magnética, tomografía computarizada clínica e histología (después de imágenes en 3D y desmontaje). Finalmente, si bien el equipo de imagen específico puede ser especializado, el protocolo de preparación se puede implementar en cualquier laboratorio biológico con una campana extractora adecuada. Los equipos y materiales están disponibles a través de proveedores científicos estándar, siendo el equipo más especializado una bomba de vacío y una cámara desecadora.

Aunque este procedimiento presenta varias ventajas en comparación con otros protocolos de preparación de muestras, cabe señalar algunas limitaciones.

El momento de los diferentes pasos del protocolo que implican fijación y desgasificación depende en gran medida de la composición y el tamaño del tejido. En el presente procedimiento, damos ejemplos de sincronización para diferentes órganos humanos; mientras que para otros tipos de tejidos sería necesario probar y verificar el momento oportuno. En este protocolo se proporcionan algunas pautas para la optimización de los tiempos.

Si bien la fijación del órgano es fundamental para la conservación del tejido a largo plazo, altera las propiedades mecánicas51,52 y de difusión del tejido, lo que podría confundir otras mediciones. A pesar de aumentar el contraste de la imagen, la deshidratación con etanol también afecta las propiedades mecánicas del tejido43,53. Esto limita el uso de este método de preparación para pruebas in situ; sin embargo, al no fijar el tejido y reemplazar el etanol con agua, es posible utilizar imágenes in situ13,54. Por lo tanto, el protocolo podría ampliarse en el futuro para cubrir experimentos dinámicos y la cuantificación de propiedades mecánicas en un corto período de tiempo (ya que se produciría degradación biológica). Si el contraste proporcionado por el etanol no es lo suficientemente alto, o no se adapta a las necesidades experimentales, se podrían utilizar varios agentes de contraste, como los agentes de contraste a base de yodo55 o a base de tungsteno56, para aumentar el contraste general del tejido o resolver componentes específicos. de interés13,56. Si el gel de agar no fuera deseable para una aplicación particular, podría reemplazarse con otros medios sólidos o elásticos que estarían en equilibrio con el líquido de montaje y serían relativamente amorfos en su estructura. Por ejemplo, en caso de montar con etanol al 96%, se puede utilizar gel de cristal de vela transparente en lugar de gel de agar. En caso de montaje con agua también se pueden utilizar bloques de gelatina o bloques de poliacrilamida.

Uno de los principales inconvenientes de los métodos de inclusión húmeda es la formación de burbujas debido a la tasa de dosis o la acumulación de dosis en el caso de sCT57. Estas burbujas pueden mover o dañar la muestra, además pueden crear fuertes artefactos, reduciendo drásticamente la calidad de la imagen58. Aunque las burbujas son un problema con otros métodos de preparación estándar, por ejemplo, la inclusión en parafina, no están presentes en el secado en el punto crítico. En este protocolo, el problema se mitiga mediante múltiples pasos de desgasificación durante el procedimiento, lo que retrasa la nucleación de burbujas durante la exploración y se mitiga aún más mediante el uso de rayos X de alta energía con un fuerte contraste de fase. Sin embargo, sólo unas pocas líneas de luz están equipadas para obtener imágenes de tejido blando a alta energía con suficientes propiedades de coherencia y capacidades de propagación. La coherencia espacial debe ser lo suficientemente alta como para que la distancia de propagación pueda establecerse para distinguir la variación de densidad de la muestra sin borrosidad geométrica. Para la tomografía de rayos X de baja energía, los pasos de desgasificación deben realizarse concienzudamente y la tasa de dosis debe controlarse aún más cuidadosamente debido a la fotodisociación de la molécula de agua.

El tejido biológico se puede recolectar mediante varios métodos. Si la muestra se recolecta directamente de un biobanco, cirugía o trasplante desestimado (Paso 1B), se puede llevar directamente a la etapa de fijación de la muestra (Paso 2). Si los órganos provienen de un cuerpo donado, se debe realizar la extracción del órgano (Paso 1A(ii)). El embalsamamiento del cuerpo se lleva a cabo poco después de la muerte, antes de la extracción del órgano (por un médico autorizado). El cuerpo se fija inyectando formalina diluida en una solución que contiene lanolina en la arteria carótida derecha (Paso 1A (i)). Después de la evisceración, se asegura la fijación completa del órgano sumergiéndolo en formaldehído tamponado neutro al 4% (Paso 2). La duración de la fijación está definida por el tamaño del órgano, por ejemplo, 4 días para un cerebro humano. Al eviscerar el órgano, asegúrese de eliminar la mayor cantidad posible de tejido circundante para disminuir el tiempo de penetración del fijador en el órgano. El volumen de fijador también es importante, recomendamos un volumen al menos cuatro veces el volumen del tejido.

Algunos órganos, como el pulmón, pueden requerir inflación. Esto se puede lograr parcialmente en la etapa de fijación mediante la instilación de formalina en los pulmones bajo presión controlada59. El pulmón se perfunde con formalina al 4% a través de la tráquea utilizando una columna de agua de 30 cm; luego se puede ligar la tráquea para mantener la configuración inflada durante un período de 2 días. Posteriormente, el pulmón se sumerge en una solución de formalina al 4% después de la extracción. Una vez fijado, la sustitución de formalina por baños sucesivos de etanol con bombeo de vacío se combina con la inyección de etanol en los bronquios para mantener una forma 3D consistente. Actualmente no es posible controlar estrictamente la presión con desgasificación de etanol con el protocolo propuesto, pero debería ser posible utilizando la circulación de etanol desgasificado instilado a una presión controlada. Nuestros resultados muestran que, incluso sin una inflación estrictamente controlada en la etapa de deshidratación del etanol, los datos todavía tienen una gran utilidad científica.

El órgano se deshidrata con múltiples baños de etanol previamente desgasificados. La transición al etanol al 70% debe ser gradual para evitar la contracción43. Se eligió una concentración de etanol del 70% como el mejor compromiso entre la contracción controlada y un contraste suficiente para observar estructuras de interés utilizando contraste de fases; sin embargo, se puede utilizar una concentración final de etanol diferente dependiendo de la aplicación. Durante este paso, se debe realizar una desgasificación para eliminar el gas libre y disuelto presente en el tejido para evitar la formación de burbujas o el aumento de volumen durante la obtención de imágenes. Para los órganos humanos presentamos dos métodos, dependiendo de la fragilidad del órgano para la deshidratación y desgasificación. La desgasificación al vacío (Paso 4A(i-v)) se puede utilizar para la mayoría de los órganos (corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo). El órgano se sumerge a temperatura ambiente (20 °C) en cuatro baños sucesivos de etanol previamente desgasificado en concentraciones del 50%, 60% y 70%, y luego en un segundo baño al 70% para garantizar que se alcance el equilibrio. Se realiza una etapa de desgasificación entre baños. El equilibrio generalmente se alcanza en 4 días para cada concentración en un órgano humano como un pulmón o un corazón. La desgasificación se realiza con una bomba de vacío y un desecador mediante ciclos sucesivos hasta una presión absoluta entre 15 y 10 mbar. La desgasificación se considera adecuada cuando a 10 mbar no se observan fuertes burbujas. Alternativamente, se desarrolló el ciclo térmico (entre temperatura ambiente y 4 °C) (Paso 4B(i)) para órganos frágiles, como el cerebro humano, ya que se observaron algunos daños después de usar el método de desgasificación al vacío36 si las burbujas no podían encontrar una salida del cerebro. En este método se realizan cuatro ciclos térmicos sumergiendo el órgano en cuatro baños sucesivos de 50%, 60% y 70%, y un segundo etanol al 70% predesgasificado. Cada ciclo térmico consiste en sumergir el órgano en el baño de etanol altamente desgasificado a temperatura ambiente. El recipiente debe cerrarse con cuidado para evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Luego se conserva en refrigeración durante 4 a 5 días a 4 °C. Durante este período, el gas disuelto se difundirá en el etanol circundante y las burbujas se disolverán progresivamente. Pasado este tiempo, las soluciones y el órgano deben volver a alcanzar la temperatura ambiente y se puede iniciar un nuevo ciclo utilizando un nuevo baño de etanol fuertemente previamente desgasificado. Para ambos métodos, el número mínimo de baños de etanol es cuatro para alcanzar una concentración final del 70% sin tener una contracción sustancial. Los tiempos de inmersión deben adaptarse y optimizarse al tipo y fragilidad del órgano. El resultado de la desgasificación puede comprobarse haciendo una radiografía del órgano en su recipiente sin los medios de montaje que se describen a continuación. Si aún quedan burbujas visibles, se pueden realizar más ciclos térmicos con etanol al 70%. Los órganos con tejido adiposo, como el cerebro, requieren más tiempo para equilibrarse con el etanol. En cada etapa, la deshidratación se puede controlar agitando el recipiente con el órgano dentro y buscando rayas de diferente densidad (diferente transparencia) que se forman en la solución de etanol circundante, esto indica la presencia de agua en el etanol.

La deshidratación con etanol es suficiente para observar las estructuras de interés con µCT y sCT cuando se utiliza contraste de fases; sin embargo, debería ser posible combinar este protocolo con el uso de un agente de contraste para resolver componentes específicos de la muestra o cuando se utilizan técnicas de imagen menos sensibles56. El agente de contraste debe ser miscible con etanol al 70% o debe aplicarse al órgano fijado antes de la deshidratación con etanol. Los agentes de contraste aumentarían la absorción de la muestra, lo que puede mejorar la formación de burbujas durante la obtención de imágenes si se utiliza un haz de rayos X de sincrotrón intenso.

En los casos en que la técnica de caracterización no sea compatible con etanol (por ejemplo, resonancia magnética para difusión), se puede aplicar el mismo protocolo de desgasificación y luego de montaje utilizando agua con formalina a la concentración deseada. Para aplicaciones in situ que requieren condiciones cercanas a las biológicas, este protocolo también se puede usar solo con agua, pero las muestras se pueden usar solo durante unas pocas horas, ya que se produciría una degradación biológica. Se deben tener en cuenta aspectos de seguridad específicos (trabajo bajo una campana extractora adaptada en un laboratorio bien ventilado, uso de guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad), ya que las soluciones de formalina o etanol producen vapores peligrosos.

Uno de los principales problemas de la incrustación húmeda es la presencia de burbujas. Estos pueden provenir del protocolo de montaje (burbujas en los órganos o atrapadas en el medio de montaje) y/o de dosis de rayos X muy altas que resultan en la evaporación del etanol (en el caso de sCT). En ambos casos pueden crear artefactos sustanciales (Fig. 3) y, en caso de burbujas debido a la dosis de rayos X, los movimientos de las burbujas durante la exploración a menudo inutilizan las exploraciones60,61. Las pruebas preliminares demostraron que desgasificar la muestra antes de obtener imágenes elimina las burbujas atrapadas y retrasa la nucleación y el crecimiento de nuevas burbujas. Por lo tanto, se incorporaron varios pasos de desgasificación en el protocolo para mitigar la formación de burbujas.

a – d, Artefactos debidos a la dosis de radiación (a, b) o a una burbuja estable atrapada durante el montaje (c, d). a, Una sección transversal de un hígado humano con numerosas burbujas que se han desarrollado debido a una absorción de dosis demasiado alta debido a una exploración que se estrelló con el haz encendido durante varias horas, provocando artefactos en las imágenes. ba, artefacto burbuja. b, Imagen de una sección transversal del hígado después de la eliminación de burbujas mediante la desgasificación de la muestra con desgasificación al vacío. c, Una sección transversal de un cerebro humano con una burbuja atrapada durante el montaje. d, Un zoom de la burbuja atrapada dentro del cerebro. Las imágenes se obtuvieron en la línea de luz BM05 en ESRF. Todos los experimentos siguieron las regulaciones éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos con humanos.

El propósito de este paso es mantener el órgano en posición durante la exploración para evitar artefactos de movimiento y garantizar que se puedan realizar más exploraciones en una etapa posterior con un buen registro rígido 3D entre exploraciones/experimentos posteriores. El gel de agar no se puede preparar con etanol al 70% directamente, sino que se debe hacer agregando lentamente polvo de agar agar en agua desmineralizada caliente agitada (~85 °C) hasta 20 g/L. Una vez completamente disuelta, la solución de agar agar se vierte en un recipiente adecuado y se deja enfriar durante varias horas. Una vez gelificada, la mezcla se puede cortar en cubos pequeños (Paso 8) y agregar al 96% de etanol (6 L:2 L de etanol:agar agar) (Paso 9), asegurando una concentración final de etanol del 70%. Después de desgasificar (Paso 12) y triturar una parte de los cubos de agar (Paso 14), la mezcla está lista para montar. Si se prefiere el montaje con formalina al etanol (p. ej., para mejorar el contraste con la resonancia magnética), el baño de etanol al 96% se puede reemplazar con un baño de formalina al 4%. El gel de agar se puede preparar con antelación y almacenar en un recipiente hermético para evitar la reintroducción de gas en la solución tras su desgasificación. La cantidad preparada depende del tamaño del órgano y del recipiente utilizado para el montaje final. Un gel de agar preparado con etanol al 70% garantiza una reducción drástica de la formación de burbujas durante la toma de imágenes. Es importante utilizar un gel de agar triturado y no un gel de agar mezclado, ya que el gel mezclado no sujeta la muestra con tanta firmeza como el gel de agar triturado y podría provocar movimiento durante la toma de imágenes. Inicialmente, sólo se utilizaron cubos de agar para mantener la muestra en posición; sin embargo, se descubrió que los cubos eran demasiado rígidos, lo que creaba deformaciones donde entraban en contacto con la superficie de órganos blandos como los pulmones. Por lo tanto, los cubos sólo deben usarse en la parte inferior y superior del recipiente. Se utilizan unos pocos centímetros para crear una base sólida y evitar la rotación de la muestra (Paso 16). Se utiliza agar triturado en el resto del recipiente para mantener la muestra en su posición. La mezcla de agar triturado en el líquido de montaje (70% de etanol o 4% de formalina) se debe agregar al recipiente suavemente con un cucharón para evitar que queden atrapadas burbujas de gas durante el proceso (Fig. 4c). Se debe realizar una desgasificación rápida al vacío al menos tres veces al agregar el gel triturado de agar para eliminar las burbujas atrapadas. Estos ciclos de vacío deberían realizarse idealmente hasta 15 mbar. Las dimensiones del recipiente deben ser lo más cercanas posible a las de la muestra para minimizar la cantidad de material que debe atravesar el haz de rayos X; sin embargo, el órgano no debe tocar el costado del recipiente para evitar artefactos en las imágenes que comprometerían la precisión de la reconstrucción (es decir, un mínimo de 5 mm de gel de agar triturado debe rodear el órgano para evitar el contacto directo con el recipiente). . Para sCT, el recipiente utilizado para el montaje debe estar fabricado de un material resistente a los rayos X y no demasiado denso, como el tereftalato de polietileno. Se debe evitar el vidrio ya que su alta densidad en comparación con las muestras daría lugar a fuertes artefactos de contraste de absorción. Una vez que el gel de agar se haya compactado alrededor de la muestra (Paso 22) y se haya desgasificado adecuadamente, el recipiente se puede sellar con una tapa hermética (Paso 28). Se debe evaluar el montaje para garantizar que no sea posible ningún movimiento de la muestra en el recipiente y que no se puedan ver burbujas en el interior. Si algunas burbujas quedan atrapadas, se puede utilizar una desgasificación rápida al vacío para eliminarlas. Se puede utilizar el mismo enfoque para eliminar burbujas en un órgano en caso de que se produzcan burbujas debido a una dosis alta durante la exploración por sCT (no desgasifique el recipiente sellado, retire la tapa, coloque un tamiz plano rígido encima del gel de agar para evitar movimiento del órgano y luego desgasificar, complementar el nivel de etanol si disminuye y eventualmente agregar una pequeña cantidad de gel de agar triturado, luego cerrar nuevamente). En el vídeo complementario 1 en línea se muestra un ejemplo de agar insuficientemente compactado. Con el órgano fijado y colocado en etanol al 70%, la muestra se puede almacenar durante años (Fig. 4d).

a, Desgasificación del órgano en su recipiente mediante desecador y bomba de vacío. b,c, Después de la compactación del gel de agar presente en el recipiente, se retira parte del etanol utilizando una jeringa y un tamiz (b), luego se añade el gel de agar (c). Este proceso continúa hasta que el gel de agar esté lo suficientemente comprimido alrededor de la muestra para mantenerla en posición. d, Muestra montada, estabilizada y desgasificada en gel de agar, lista para ser escaneada. e, Esquema de un cerebro montado, como en d, fijado con gel de agar triturado y cubos de agar, en un recipiente sellado. Todos los experimentos siguieron las regulaciones éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos con humanos. Panel e imagen del cerebro de Smart Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) bajo licencia CC BY 3.0.

Las imágenes de rayos X y la reconstrucción 3D no se describen en detalle en este protocolo; sin embargo, una descripción detallada está disponible en la literatura36 o contactando a los autores correspondientes. Este método se desarrolló para imágenes de órganos grandes con HiP-CT, pero muchos aspectos serían beneficiosos para imágenes más clásicas de sCT y μCT (fuente de laboratorio) en muestras más pequeñas, incluida la inmovilización y la mejora del contraste relacionadas con la preparación de etanol. Una vez montada la muestra, la exploración se puede realizar en cualquier momento; en la figura 2 se muestran los resultados típicos de las imágenes por sCT de un corazón humano intacto. La principal limitación de esta técnica es la nucleación y el crecimiento de burbujas después de la aplicación de dosis altas. Radiografía del órgano en el caso de sCT. Si solo aparecen unas pocas burbujas durante la toma de imágenes, la muestra se puede dejar en el refrigerador a 4 °C para disolverlas nuevamente. Si esto no tiene éxito, la muestra se puede volver a desgasificar con bombeo de vacío sin tener que desmontarla, pero inevitablemente habrá algunos pequeños movimientos de la muestra durante el proceso, lo que complica el procedimiento de escaneo y registro multiresolución. Existen varias soluciones para evitar la formación de burbujas durante la sCT, para la optimización de la detección, el aumento del contraste relativo para trabajar con dosis más bajas, un mejor control de la dosis, un mejor procesamiento de los datos o tener un período de descanso para las muestras entre escaneos sucesivos de la misma. área. El burbujeo parece estar fuertemente relacionado con el efecto térmico de la dosis sobre la tasa de evaporación del etanol. Desarrollar cámaras ambientales de muestra para que funcionen a una temperatura más baja y garantizar un mejor equilibrio térmico puede ser una forma eficiente de aliviar el riesgo de burbujeo relacionado con el uso de etanol al 70%, especialmente para múltiples exploraciones con resolución submicrónica en el mismo órgano.

El método de preparación de muestras presentado en este protocolo es compatible con la resonancia magnética (Fig. 5c), lo que lo hace altamente adaptable a estudios multimodales. Sin embargo, se deben tener en cuenta una serie de consideraciones antes de decidir el método de preparación de la muestra y el orden de escaneo. La deshidratación de la muestra con etanol aumenta el contraste de las imágenes de rayos X, pero puede afectar las imágenes de RM62. La mayoría de las técnicas de RM dependen en gran medida del contenido de agua. Por lo tanto, al deshidratar la muestra, se mejora el contraste entre los tejidos que retienen bien el agua (p. ej., tejido adiposo) y aquellos que se deshidratan eficientemente (p. ej., tejido muscular). Sin embargo, al disminuir el contenido total de agua, la señal se reduce y algunas técnicas como la RM ponderada por difusión ya no son posibles. Un método para superar este problema es no deshidratar la muestra sino prepararla directamente en un montaje de formalina para realizar primero la resonancia magnética. Luego se reduce el contraste de las imágenes de sCT, pero aumenta la relación señal-ruido de las imágenes de MRI. Aunque el tejido fijado con formalina o paraformaldehído es el método de preparación de muestras más utilizado para la resonancia magnética ex vivo, esta técnica también afecta la calidad de las imágenes63. La fijación del tejido con formalina o paraformaldehído reduce T1, T2 y la difusividad del tejido, reduciendo así el contraste con el ruido en las imágenes. Un enfoque es lavar el cerebro para eliminar el fijador antes de la resonancia magnética, lo que puede restaurar los valores T2 previos a la fijación, aunque no los valores T1 (ref. 64). El lavado también comprometerá los pasos de desgasificación anteriores, por lo que la importancia relativa de cada modalidad de imagen se debe sopesar cuidadosamente con la tubería general de imágenes y los requisitos de registro multimodal.

a, vista 3D del riñón humano. b, Corte transversal del riñón obtenido con TC médica, con un tamaño de vóxel de 625 µm. c, Corte transversal del riñón obtenido con una resonancia magnética médica 3T, con un tamaño de vóxel de 220 × 200 × 200 µm3. d, Corte transversal del riñón obtenido con sCT, con un tamaño de vóxel de 25 µm en la línea de luz BM5 ESRF. e, Comparación de sCT y una sección histopatológica teñida con hematoxilina y eosina (H&E). La histología se realizó después de todas las demás modalidades de imagen. Las técnicas histológicas utilizadas son estándar y están bien documentadas en la ref. 72. La columna de la izquierda muestra imágenes de micrografía óptica de secciones histopatológicas teñidas con H&E, la columna de la derecha muestra imágenes sCT 2D tomadas en la línea de luz BM05 en ESRF con un tamaño de vóxel de 1,4 μm. Las imágenes con una estrella en la parte superior izquierda han sido pseudocoloreadas (de sCT) o convertidas a niveles de gris antes de invertirlas en contraste (de histología). Toda la información básica sobre el paciente del que se origina este órgano se proporciona en la Figura 2 de Datos ampliados. Todos los experimentos siguieron las regulaciones éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos en humanos. Panel e adaptado con permiso de la ref. 36, Springer Nature América, Inc.

El protocolo aquí descrito requiere experiencia previa en el manejo de órganos humanos o animales. Si se utilizan órganos humanos, un patólogo debe ser parte del estudio para encargarse del embalsamamiento corporal y la disección de órganos. La desgasificación del órgano, la preparación de la solución de agar y el montaje del órgano requieren la experiencia de un técnico de laboratorio, ya que estos pasos implican el manejo de materiales peligrosos como la formalina y la solución de etanol. Este protocolo fue desarrollado y optimizado para obtener imágenes de órganos grandes; se requiere un científico que tenga experiencia en CT o sCT, ya que obtener imágenes de estructuras tan grandes no es trivial.

Todos los experimentos aquí incluidos fueron autorizados por el ESRF, el Laboratoire d'Anatomie des Alpes Françaises y el Instituto de Patología de Hannover en Medizinische Hochschule, Hannover (voto de ética n.° 9022_BO_K_2020). Los protocolos de transporte e imágenes fueron aprobados por la Autoridad de Investigación en Salud y el Sistema Integrado de Aplicación de Investigación (200429) y el Ministerio de Salud francés. Todas las disecciones de órganos respetaron la memoria del difunto. El estudio post mortem se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la escala de Evaluación de Calidad de Estudios Cadavéricos65.

Se deben buscar y seguir las regulaciones éticas institucionales y gubernamentales relativas al uso de tejido humano en la investigación antes de realizar cualquier procedimiento descrito en este protocolo. Los requisitos específicos serán fijados por las autoridades pertinentes. Normalmente, después de identificar una muestra adecuada, ya sea de una donación de cuerpo o de un biobanco, un comité de ética debe revisar el proyecto. Una vez aceptado el proyecto, se deben establecer contratos y/o Acuerdos de Transferencia de Material (MTA) para transferir las bioespecímenes entre instituciones. El tiempo necesario para obtener el acuerdo ético y el MTA puede ser considerable (desde varias semanas hasta años), dependiendo de los países involucrados y las especificidades del contrato.

Órganos humanos obtenidos de un cuerpo donado

Se deben seguir las normas éticas institucionales y gubernamentales relativas al uso de seres humanos para la investigación científica.

Formalina tamponada neutra al 4 % (50 % Hygeco, n.º de cat. 07040 + 50 % Hygeco, n.º de cat. 07020; diluido al 4 %)

Tóxico, cancerígeno, mutagénico, reprotóxico e inflamable. Manipular con cuidado, en campana extractora. Evite la inhalación y la exposición de la piel o los ojos.

Etanol 96% (Cheminol France, cat. no. 20× 4-2)

Agar Agar (Nature et Aliments, cat. no. 510190)

Las propiedades gelificantes del agar difieren según el productor. Recomendamos utilizar el proveedor enumerado para reproducir los resultados presentados aquí. Si se utilizan otros, se requerirán algunas pruebas preliminares.

Agua desmineralizada (Sigma Aldrich, cat. no. 38796)

Campana de extracción (laboratorio Iberis, nº cat. SPR18)

Guantes Nitril (Showa, cat. no. 7500PF)

Toallas de papel (Paredes, n.º cat. 404857)

Instrumentos de disección (Fisher Scientific, n.º de cat. 11738551)

Bomba de vacío (Marshall Scientific, n.º de cat. VME8)

Desecador de vacío (SP Bel-Art, n.º de cat. F42400-4031)

Refrigerador (Fisher Scientific, n.º de cat. 22651264)

Recipiente grande a prueba de fugas en tereftalato de polietileno (Medline Scientific, n.º de cat. 129-0592, o Lock & Lock, n.º de cat. INL-403 o Lock & Lock, n.º de cat. INL-203, que se muestra en la figura de datos ampliados 4)

Sistema de vórtice magnético equipado con una placa calefactora (Fisherbrand, n.º de cat. 15349654)

Rallador eléctrico (Seb, n.º cat. DO201141)

Cucharón (Tefal, n.º de cat. K1180214)

Cuchillo largo (Ikea, n.º cat. 402.947.22)

Jeringa de 50 ml (PentaFerte, n.º de cat. 002022960)

Tamiz (Profilstore, nº cat. toilinox_PGRI1ME213)

Cinta de vinilo de uso general (3 M, n.º de cat. 764)

Taladro (DeWALT, n.º de cat. DCD791P2-QW)

Portacontenedores (hecho a medida, descrito en Datos Ampliados Fig. 5 y en ref. 36)

Configuración de microtomografía sincrotrón. Utilizamos las líneas de luz BM05 y BM18 del ESRF. Los parámetros de la línea de luz de todas las exploraciones de órganos presentadas en este artículo se detallan en la Fig. 6 de datos ampliados.

Reconstrucción de datos: Servidor en rack Dell EMC PowerEdge R7525 (sistema operativo: Ubuntu 20.04.3 LTS; unidad central de procesamiento: AMD EPYC 75F3 2,95 GHz, 64 núcleos; memoria: DDR4-3200 32 GB (32×); unidad de procesamiento de gráficos: NVIDIA Ampere A40 ×2; disco duro: 2,4 TB 10 K RPM SAS 12 Gbps)

Visualización de datos: Dell Precision 7920 Tower (sistema operativo: Windows Server 2016; unidad central de procesamiento: procesador Intel Xeon Platinum 8160 M, 2,10 GHz, 24 núcleos; memoria: 1,5 TB; unidad de procesamiento gráfico: NVIDIA Quadro P6000; disco duro: AVAGO MR9460 -16i SCSI 4,67 TB)

Código de reconstrucción escrito internamente usando MATLAB 2017 disponible en GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon)

PyHST2 (código de reconstrucción tomográfica 3D, http://ftp.esrf.fr/scisoft/PYHST2, código abierto) desarrollado por la ESRF

ImageJ/Fiji (procesamiento previo y posterior de datos, https://imagej.nih.gov/ij/, http://fiji.sc/, código abierto)

VGSTUDIO MAX versión 3.5 (segmentación y visualización de volúmenes, https://www.volumegraphics.com/en/products/vgsm.html)

Cualquier experimento que implique el uso de órganos humanos debe ser aprobado éticamente por los comités institucionales o gubernamentales pertinentes.

Recoger el órgano de interés ya sea extrayéndolo de un cuerpo donado (opción A) o a través de un biobanco, una cirugía o un trasplante descartado (opción B).

Embalsamamiento del cuerpo y extracción de órganos.

Tiempo ~3 días

(Opcional) Embalsamar el cuerpo después de la muerte inyectando secuencialmente 4.500 ml de formalina diluida al 1,15% en una solución que contenga lanolina y 4.500 ml de formalina diluida al 1,44% en la arteria carótida derecha (realizada por un médico autorizado), idealmente con un drenaje yugular. .

La formalina es volátil y altamente tóxica. Es un irritante para los ojos, las vías respiratorias y la piel y un probable carcinógeno. Trabaje dentro de una campana extractora de productos químicos en un área bien ventilada y use equipo de protección personal adecuado (guantes, protección para los ojos y bata de laboratorio).

El cuerpo se puede almacenar hasta 2 años si se fija y refrigera adecuadamente.

Extraer los órganos de interés del cuerpo.

Retire la grasa circundante y el tejido conectivo.

Obtención de órganos de un biobanco

El tiempo depende de los retrasos administrativos y de entrega.

Recuperar el órgano de un biobanco, de una cirugía o de un trasplante desestimado. El tiempo entre la recuperación del órgano y la fijación con formalina debe ser mínimo. Mientras tanto, el órgano debe mantenerse a 4 °C para evitar la degradación del tejido. Los datos de los donantes deben ser anónimos de acuerdo con las regulaciones gubernamentales. El órgano debe transportarse en un recipiente sellado.

Sincronización 4 días

(Opcional) Fije completamente el órgano sumergiéndolo en formalina tamponada neutra al 4% a temperatura ambiente. Utilizamos 4 días de fijación con formalina para cumplir con las normas de seguridad vinculadas a las autopsias en caso de agente patógeno (como COVID-19). Recomendamos que el volumen de formalina sea al menos cuatro veces mayor que el volumen del órgano. El volumen lo estima el patólogo, para quien esta es una práctica habitual.

La desgasificación con bomba de vacío debe realizarse bajo una campana extractora o en una habitación equipada con un sistema de ventilación de capacidad suficiente para evitar la inhalación de gases de formalina o etanol.

La temperatura ambiente se fijó normalmente en 20 °C.

(Opcional) Lave la muestra con agua del grifo durante 2 minutos para eliminar el fijador.

Preparar el órgano para el montaje por deshidratación utilizando múltiples baños de etanol y desgasificándolo al vacío (opción A). Con el protocolo de desgasificación al vacío, se pudieron observar daños en algunos órganos frágiles (normalmente el cerebro). Así, se desarrolló un protocolo alternativo para preparar la muestra sin desgasificación al vacío mediante ciclos térmicos (opción B). El etanol se puede reemplazar con una solución de formalina al 4% para evitar la deshidratación de la muestra cuando esto no sea deseable, por ejemplo, imágenes por resonancia magnética o en el caso de imágenes de rayos X con contraste cercano a las condiciones biológicas. Es posible que sean necesarias modificaciones a este procedimiento ya que el tiempo y el número de ciclos dependen en gran medida de la composición y el tamaño del órgano. Para muestras de diferente origen, tipo y tamaño, se debe considerar cierta optimización de este paso.

Deshidratación y desgasificación al vacío.

Tiempo 16 días

Sumergir el órgano en un baño de etanol al 50% previamente desgasificado. La solución debe tener al menos cuatro veces el volumen del órgano.

Colocar el recipiente con el órgano dentro de un desecador.

Retire el gas libre y disuelto en el tejido disminuyendo la presión mediante ciclos sucesivos utilizando una bomba de vacío de diafragma hasta que se produzca un fuerte burbujeo.

Los primeros ciclos suelen durar de 2 a 3 minutos y alcanzan los 15 a 30 minutos después de tres o cuatro ciclos para un órgano humano, como un corazón o un riñón.

Estos tiempos dependen en gran medida de la configuración de vacío del usuario.

Continúe estos ciclos hasta alcanzar 15-10 mbar sin fuertes burbujas.

La desgasificación debe realizarse en ciclos de mayor duración. Para cada ciclo, el bombeo de vacío se detiene cuando el burbujeo se vuelve repentinamente más intenso. Cada vez que comienza un nuevo ciclo, el tiempo antes de la formación de la primera burbuja debería aumentar. El tiempo de desgasificación debe adaptarse a cada órgano en función de su composición y tamaño. No existe un momento típico; debe elegirse empíricamente observando el régimen de burbujeo. Esto dependerá en gran medida de la calidad de la bomba de vacío y del desecador.

Solución de problemas

Espere hasta el equilibrio (nuestras pruebas muestran que normalmente 4 días para un órgano humano como pulmón, corazón o cerebro son suficientes para cada concentración de etanol; con solo 2 días, vimos un equilibrio incompleto visible como gradientes de densidad en las exploraciones).

Repita los Pasos (i-vi) con tres baños sucesivos de etanol predesgasificado al 60%, 70% y finalmente 70% con una desgasificación entre cada baño.

Realice una desgasificación final del órgano durante unos minutos justo antes de montarlo con el gel triturado de agar-agar en el frasco de montaje.

Deshidratación y ciclos térmicos desgasificación (protocolo alternativo para órganos frágiles)

Tiempo 27 días

Se deben realizar al menos cuatro ciclos térmicos cada uno en concentraciones sucesivamente mayores de 50%, 60%, 70% y 70% de etanol.

Para cada concentración sucesiva, utilizar la bomba de vacío para desgasificar un volumen de etanol de al menos cuatro veces el volumen del órgano, a temperatura ambiente.

Añadir el etanol al recipiente con la muestra y cerrar el recipiente con cuidado para evitar atrapar burbujas.

Almacenar a 4 ° C durante 5 d. El gas disuelto se difundirá en el etanol circundante y las burbujas se disolverán progresivamente. Los tiempos de inmersión deben adaptarse y optimizarse al tipo y fragilidad del órgano.

Para cada ciclo, retire el recipiente del refrigerador para que vuelva a alcanzar la temperatura ambiente (~12 h). Se puede utilizar un termómetro para medir la temperatura de la solución.

El resultado de la desgasificación puede comprobarse haciendo una radiografía del órgano en su recipiente sin los medios de montaje que se describen a continuación. Si aún quedan burbujas visibles, se pueden realizar más ciclos térmicos con etanol al 70%. Los órganos con tejido adiposo, como el cerebro, requieren más tiempo para equilibrarse con el etanol.

Una vez que tenga etanol al 70%, el órgano se puede almacenar a temperatura ambiente durante meses o años antes de continuar con los pasos de montaje del protocolo.

Solución de problemas

Duración 12 h a 2 d

Para 5 litros de gel de agar se obtienen:

Hervir 5 litros de agua desmineralizada en un recipiente utilizando una placa caliente equipada con un sistema de vórtice magnético.

El agua hirviendo o el vapor pueden provocar quemaduras graves. Nunca transporte el contenedor lleno con la mano. En su lugar, llévelo sobre un carrito o una plataforma rodante. Utilice equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad) y trabaje en una habitación bien ventilada.

Una vez por encima de 80°, vierta lentamente 100 g de agar agar (20 g/L) en polvo en el agua y mantenga el vórtex hasta una buena disolución.

Una vez disuelto detener la agitación y retirar el agitador con un cucharón.

Vierta el líquido en un recipiente grande. Normalmente utilizamos un recipiente de 40 × 30 × 12 cm.

El agua hirviendo o el vapor pueden provocar quemaduras graves. Utilice equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad) y trabaje en una habitación bien ventilada.

Una vez lograda la gelificación (~12 h dependiendo de la temperatura), cortar el gel de agar con un cuchillo largo en cubos de ~2 cm3.

Utilice los cuchillos con cuidado y concéntrese siempre en lo que está haciendo.

Sumergir los cubos en 11,7 L de etanol al 96% en un recipiente de 20 L. La relación de volumen se elige para asegurar una concentración final de etanol del 70%. Si el órgano se preparó con una solución de formalina al 4% en lugar de etanol para evitar la deshidratación de la muestra, reemplace el etanol al 96% con formalina al 4%.

El etanol es inflamable, manténgase alejado de fuentes de calor y tenga siempre a mano un extintor. La manipulación de etanol o formalina siempre debe realizarse bajo una campana extractora. Evite la inhalación y la exposición de la piel o los ojos. Utilice equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad). Espere hasta que la densidad de los bloques sea cercana a la del etanol (~ 24 h).

Verifique el equilibrio de la solución agitándola para poner los cubos de gel en suspensión y asegúrese de que se hundan lentamente hasta el fondo del recipiente (durante varias docenas de segundos).

Colocar el recipiente con los cubos de agar y el etanol en el desecador. Para cerrar el desecador, coloque la tapa y ciérrelo lentamente aplicando una fuerza suave. Gire con cuidado la tapa en ambas direcciones para asegurar un sello hermético. Asegúrese de que el desecador esté conectado a la bomba de vacío.

Desgasifique la solución utilizando la bomba de vacío durante dos ciclos de ~1 h para evitar romper los cubos de agar. Los cubos deben mantenerse sumergidos durante el proceso para evitar la deshidratación. Evite exponer los cubos al aire por más de 10 min. Almacenar un tercio de los cubos desgasificados con etanol al 70%, en un recipiente hermético.

Triturar los cubos restantes con un rallador eléctrico.

El uso de equipos eléctricos con 70% de etanol supone un riesgo de incendio, el aparato eléctrico en cuestión debe tener un motor con protección contra chispas y seguir las normas contra incendios adecuadas.

Guárdelo en un recipiente hermético para uso futuro con suficiente solución de etanol al 70 % para garantizar que no quede agar fuera de la solución.

Desgasifique la solución nuevamente justo antes de usarla.

Tiempo ~3 h

Llene el fondo del recipiente cilíndrico a prueba de fugas con cubos de agarosa de unos pocos centímetros de largo/ancho. El contenedor se muestra en la figura 4 de datos ampliados.

Llena la mitad del recipiente con gel triturado.

Utilice un cucharón con movimientos lentos y cuidadosos al manipular la solución de agar para evitar aumentar el gas disuelto en la solución o atrapar burbujas.

Sumerja con cuidado el órgano en el gel y colóquelo en la posición deseada para obtener imágenes. Cubrir el órgano con agar triturado.

Desgasifique todo el recipiente para eliminar las burbujas atrapadas.

Esta etapa de desgasificación sólo tiene como objetivo eliminar las burbujas atrapadas. Como todos los componentes se desgasificaron antes, esto debería limitar la cantidad de gas disuelto. Esta desgasificación al vacío debe realizarse únicamente con tiempos de bombeo cortos (2 a 3 minutos) durante varios ciclos para ayudar a eliminar las burbujas visibles.

Golpear suavemente el desecador puede ayudar a que las burbujas suban a la superficie

Agregue más solución de agar-etanol.

Utilice un colador para presionar el gel de agar desde la parte superior para compactarlo alrededor del órgano. Utilice una jeringa para eliminar el exceso de etanol de la parte superior del tamiz, luego agregue un volumen de agar y etanol equivalente a una cuarta parte del recipiente.

Tenga cuidado porque una vez que el agar está compacto, las burbujas no pueden subir fácilmente a la superficie y, por lo tanto, ya no se puede realizar la desgasificación en esta parte del recipiente. Todos los movimientos deben realizarse lenta y cuidadosamente para asegurarse de no atrapar burbujas al compactar el agar.

Aplique manualmente presión vertical alrededor de la muestra para compactar el agar alrededor de la muestra y mantenga la muestra en posición hasta que ya no pueda moverse en el frasco.

Se deben dejar al menos 5 mm de gel de agar triturado entre la muestra y la pared del recipiente para evitar efectos de borde durante la obtención de imágenes con rayos X.

Desgasifique todo el recipiente usando una bomba de vacío para eliminar el gas agregado durante los últimos tres pasos y evitar atrapar burbujas en el gel de agar. Utilice ciclos para facilitar la salida de burbujas. Después de algunos ciclos, si no se ven burbujas durante la inspección, continúe con el siguiente paso.

Repita los últimos cuatro pasos hasta que el agar esté lo suficientemente compacto debajo, alrededor y encima de la muestra para evitar cualquier movimiento de la muestra. En el vídeo complementario 1 en línea se muestra un ejemplo de agar insuficientemente compactado.

Solución de problemas

Llene el recipiente a prueba de fugas hasta el tope con la solución de agar-etanol y termine de llenarlo con algunos cubos de agar con solución para asegurar un buen bloqueo de la muestra.

Haz un pequeño agujero de unos pocos milímetros de diámetro en el centro de la tapa.

Atornille la tapa al recipiente.

Si el recipiente no es directamente hermético, utilice material sellador como látex parafilm o caucho de silicona en la rosca del recipiente para garantizar un buen sellado.

Después de sellar, verifique que se haya eliminado todo el aire del recipiente aplicando una ligera presión en la tapa y asegurándose de que el etanol salga por el orificio.

El agar puede bloquear el orificio y evitar que salga etanol, en cuyo caso utilice una aguja para limpiar el orificio.

Aplique un trozo de cinta adhesiva en el orificio de la tapa para evitar el intercambio de gases entre el interior y el exterior del recipiente y para actuar como escape de seguridad en caso de que se produzcan burbujas durante el escaneo.

Aplique cinta adhesiva alrededor de la tapa para protegerla y evitar que se abra accidentalmente.

Valorar que no queden burbujas en el recipiente. Una vez que el agar está compacto, las burbujas no pueden viajar fácilmente hasta la superficie.

El órgano montado se puede almacenar a temperatura ambiente durante meses o años antes de obtener imágenes, y se pueden obtener imágenes muchas veces sin ninguna intervención, siempre y cuando no se produzcan burbujas debido a una dosis de rayos X demasiado alta.

Solución de problemas

Variable de tiempo dependiendo de la configuración de imágenes

Los parámetros de la línea de luz de todas las exploraciones de órganos presentadas en este artículo se detallan en la figura 6 de datos ampliados. Para obtener más ejemplos de parámetros de configuración, consulte Walsh et al.36. Los pasos 37 a 43 deben ser realizados por un científico de líneas de luz de sincrotrón completamente capacitado.

En el caso de órganos montados refrigerados, saque el órgano del refrigerador al menos 12 h antes del experimento y déjelo a temperatura ambiente para evitar cualquier cambio de forma durante la obtención de imágenes debido al cambio de temperatura.

Coloque el órgano en su recipiente sellado sobre el soporte del recipiente. El soporte de contenedor hecho a medida que estamos utilizando se describe en la Fig. 5 de datos ampliados.

Coloque un segundo recipiente equivalente (llamado recipiente de referencia) encima del recipiente de muestra, lleno únicamente con el medio de montaje adecuado, como gel de etanol-agar.

Configure el detector con un tamaño de píxel que permita obtener imágenes de todo el órgano. Normalmente, para un cerebro de 14 cm con una cámara de 5.056 píxeles horizontalmente, se puede alcanzar un tamaño de píxel máximo de 27,7 µm en una adquisición normal.

Alinee el detector con el haz de rayos X.

Ajuste las rendijas de la línea de luz configurando su apertura alrededor del campo de visión.

Las rendijas bien ajustadas reducen la dosis depositada sobre la muestra.

Alinee la muestra con el detector y encuentre el centro de rotación.

Ajuste la energía y el flujo para garantizar una penetración suficiente a través de la muestra. La energía promedio óptima depende del tamaño del frasco que contiene el órgano. Normalmente, 80 keV por 10 cm, hasta 110 keV por 15 cm, especialmente si en las radiografías se ven partes densas como cartílagos o calcificaciones. El flujo se puede ajustar para ajustar la velocidad de escaneo a los requisitos del experimento mientras se encuentra en el rango de energía correcto y se mantiene una tasa de dosis suficientemente baja para evitar burbujas.

Se debe tener cuidado con la dosis depositada sobre la muestra para evitar la formación de burbujas durante el escaneo. Este paso debe ser realizado por un científico capacitado en líneas de luz. Además, este paso depende en gran medida del tipo y tamaño de la muestra, así como de las características de la línea de luz y de la calidad de la desgasificación de la muestra.

Establece el tiempo de exposición y acumulación de la cámara. Normalmente, para una señal de cámara codificada en 16 bits, un valor máximo de píxeles de 42.000 por subtrama individual permite un fuerte margen de seguridad para evitar la saturación, mientras se utiliza toda la dinámica de la cámara.

Aumentar el tiempo de exposición aumenta el tiempo de escaneo y por tanto la dosis depositada sobre la muestra.

Asegúrese de que la dinámica de la cámara esté optimizada y de que no se produzca saturación del detector durante el escaneo.

Realice un escaneo del contenedor de referencia.

Escanee el órgano completo.

La configuración de la línea de luz para el escaneo de referencia y el escaneo de muestra debe ser idéntica.

Solución de problemas

Cree un campo plano haciendo un promedio de todas las proyecciones del escaneo de referencia realizado en el Paso 44.

Realice una reconstrucción de un solo corte aplicando el campo plano calculado en el Paso 46 y utilizando un algoritmo de retroproyección filtrado66 junto con una recuperación de fase de una sola distancia para garantizar la calidad de las exploraciones (la reconstrucción se puede realizar utilizando una reconstrucción tomográfica de código abierto código, como PyHST2 (ref. 67) o TomoPy68).

(Opcional) Seleccione características de interés en las imágenes reconstruidas.

(Opcional) Calcule las posiciones del motor y alinee la muestra para obtener imágenes de la región de interés correspondiente.

(Opcional) Repita los pasos 37 a 47 para obtener imágenes de regiones seleccionadas del órgano.

Cree una integración angular parcial a partir del escaneo de referencia cada 100 proyecciones para la corrección de campo plano de radiografías de escaneo de muestra.

Aplique la corrección de campo plano en cada 100 proyecciones del escaneo de muestra con el campo plano correspondiente calculado en el Paso 50.

Reconstruya el volumen 3D utilizando un algoritmo de retroproyección filtrado junto con una recuperación de fase de una sola distancia66 y una máscara de enfoque 2D (la reconstrucción se puede realizar utilizando un código de reconstrucción tomográfica de código abierto, como PyHST2 (ref. 67) o TomoPy68).

(Opcional) Corrija los artefactos del anillo en los cortes reconstruidos utilizando el algoritmo actualizado de Lyckegaard et al.69 (código disponible en GitHub indicado en la sección Disponibilidad de código).

Tiempo variable dependiendo de la técnica de imagen.

Imagen de la muestra montada con µCT19, CT70,71 clínico o MRI63. Se pueden obtener imágenes de la muestra con tantas de estas técnicas de imágenes como se desee.

(Opcional) Realizar análisis histológico de la muestra biológica. Utilizamos técnicas histológicas estándar, bien documentadas en Ross y Pawlina72.

Los consejos para la resolución de problemas se pueden encontrar en la Tabla 1.

Paso 1, obtención de órganos: ~3 días

Paso 2, fijación del órgano: 4 d

Pasos 3–4A o 3–4B, preparación del órgano antes del montaje: 16–27 d

Pasos 5 a 16, preparación del gel de montaje de órganos: 12 h a 2 días

Pasos 17 a 32, montaje y desgasificación del órgano: ~3 h

Pasos 33 a 53, imágenes sCT: el momento depende de la técnica y la configuración de las imágenes

Pasos 54 a 55, imágenes e histología: el tiempo depende de la técnica y la configuración de las imágenes

Este protocolo proporciona un método para preparar y estabilizar órganos grandes o muestras biológicas para obtener imágenes de alta resolución mediante sCT, µCT, CT clínica o RM. Las imágenes típicas de órganos humanos se muestran en las Figs. 2 y 5. Este procedimiento de preparación de muestras proporciona imágenes de alto contraste (según la modalidad de imagen), evita el movimiento de la muestra durante el escaneo, es compatible con múltiples modalidades de imagen y preserva las características morfológicas del tejido en comparación con otros métodos de preparación de muestras como la parafina. incrustación. La muestra se puede almacenar durante al menos 1 año sin movimiento ni deterioro. Este método permite la investigación 3D de grandes estructuras biológicas, como órganos humanos, sin dañarlos. Estas imágenes de alta resolución pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre las características saludables o patológicas de un órgano, por ejemplo, el efecto del COVID-19 en los pulmones humanos36.

Los datos de imágenes utilizados para crear las figuras presentes en este documento de protocolo están disponibles públicamente en el repositorio de datos del ESRF (https://human-organ-atlas.esrf.eu) o de los autores correspondientes.

Los datos sCT se reconstruyeron utilizando un código personalizado escrito en MATLAB 2017 disponible en GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) y el paquete de software PyHST2 (https://software.pan-data.eu/software/74 /pyhst2). Se utilizó VGSTUDIO MAX 3.5 (Volume Graphics) para la renderización de volumen.

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Agradecemos a S. Bayat (INSERM) por su ayuda durante la fase de prueba, a P. Masson (LADAF) por las disecciones de cuerpos de donantes, a H. Reichert (ESRF) y R. Tori por el apoyo general del proyecto y a E. Boller, C. Muzelle, R. Homs, C. Jarnias, F. Cianciosi, P. Vieux, P. Cook, L. Capasso y A. Mirone por su ayuda en el desarrollo y las mejoras de la configuración. También agradecemos a R. Engelhardt, A. Muller Brechlin, C. Petzold, N. Kroenke y M. Kuhel por su ayuda con la histología y las autopsias. Este proyecto ha sido posible en parte gracias a la subvención número 2020-225394 de la Iniciativa Chan Zuckerberg DAF, un fondo asesorado de Silicon Valley Community Foundation y la subvención número CZIF2021-006424 de la Fundación de la Iniciativa Chan Zuckerberg, las propuestas de financiación ESRF md1252 y md1290. la Real Academia de Ingeniería (CiET1819/10). PDL y CLW agradecen la financiación del MRC (MR/R025673/1). MA reconoce subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (HL94567 y HL134229). Este trabajo fue apoyado por el Registro Alemán de Autopsias COVID-19 (DeRegCOVID, www.DeRegCOVID.ukaachen.de; apoyado por el Ministerio Federal de Salud: ZMVI1-2520COR201) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación como parte de la Red de Medicina Universitaria (DERROTA PANDEMics, 01KX2021).

Estos autores contribuyeron igualmente: J. Brunet, CL Walsh.

Departamento de Ingeniería Mecánica, University College London, Londres, Reino Unido

J. Brunet, CL Walsh, S. Marussi y Peter D. Lee

Instalación Europea de Radiación Sincrotrón, Grenoble, Francia

J. Brunet y Paul Tafforeau

Departamento de Radiología Diagnóstica e Intervencionista, Hospital Universitario de Heidelberg, Heidelberg, Alemania

W.Wagner

Centro de investigación pulmonar traslacional de Heidelberg (TLRC), Centro alemán de investigación pulmonar (DZL), Heidelberg, Alemania

W.Wagner

Laboratorio de Anatomía de los Alpes franceses (LADAF), Universidad Grenoble Alpes, Grenoble, Francia

A. Bellier

Instituto de Patología, Facultad de Medicina de Hannover, Hannover, Alemania

C. Werlein y DD Jonigk

Investigación biomédica en enfermedades pulmonares obstructivas y en etapa terminal Hannover (BREATH), Centro Alemán de Investigación Pulmonar (DZL), Hannover, Alemania

DD Jonigk

Centro de Investigación, Anatomía y Formación Quirúrgica de Amberes (ASTARC), Universidad de Amberes, Amberes, Bélgica

SE Pasado

Instituto de Patología y Patología Molecular, Clínica Universitaria Helios Wuppertal, Universidad de Witten/Herdecke, Wuppertal, Alemania

M.Ackermann

Instituto de Anatomía Funcional y Clínica, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia, Maguncia, Alemania

M.Ackermann

Complejo de investigación en Harwell, Didcot, Reino Unido

Peter D Lee

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PT, PDL, DDJ, MA, CLW y WLW conceptualizaron el proyecto y diseñaron experimentos. MA, CW, PT, AB, SEV, CLW y JB realizaron y contribuyeron a las autopsias y la preparación de muestras. PT diseñó y construyó instrumentos y realizó imágenes HiP-CT. Portamuestras diseñados por SM. PT diseñó e implementó métodos de reconstrucción tomográfica. JB, PT, CLW y PDL escribieron el artículo. Todos los autores ayudaron en la revisión y revisión del manuscrito.

Correspondencia a J. Brunet, CL Walsh, Peter D. Lee o Paul Tafforeau.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Protocols agradece a Ali Erturk, Stuart Stock y Hiroki Ueda por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Este protocolo se desarrolló de manera iterativa superando todos los diferentes desafíos relacionados con la obtención de imágenes de tejidos blandos, la deposición de dosis y la tomografía local.

Los datos del corazón, los riñones y el cerebro están presentes en el Human Organ Atlas (https://human-organ-atlas.esrf.eu). Los datos del hígado no están incluidos en el Human Organ Atlas debido a la gran cantidad de artefactos presentes en las imágenes debido a la formación de burbujas durante el escaneo. Sin embargo, las imágenes están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes. La formación de estas burbujas se produjo porque un fallo en el software de la línea de luz provocó que el haz permaneciera en la misma posición durante varias horas, superando el umbral de dosis del órgano. Se han escaneado otros hígados sin artefactos.

El proceso descrito en este documento de protocolo debería funcionar para todos los órganos principales, pero solo se han probado los órganos enumerados aquí. Los tiempos máximos de desgasificación enumerados aquí son específicos de nuestra configuración de desgasificación al vacío y están sujetos a cambios según la bomba, el volumen a bombear, la sección de bombeo, la cantidad de gas a evacuar y los caminos que el gas puede tomar hasta dejar la muestra. Como tal, deben adaptarse a la configuración de vacío de cada usuario observando la intensidad del burbujeo como se explica en el Paso 4A(ii) del protocolo.

El recipiente a prueba de fugas izquierdo es un recipiente de Medline Scientific (n.° de cat. 129-0592) de 3 L. El recipiente a prueba de fugas derecho es un recipiente Lock & Lock (n.° de cat. INL-403) de 2,1 L. Ambos están dentro de un soporte de contenedor hecho a medida que se describe en Datos ampliados Fig. 5.

En el interior del portacontenedores hecho a medida se representan dos contenedores. El contenedor inferior contiene la muestra, mientras que el contenedor superior, denominado contenedor de referencia, se utiliza para la corrección de campo plano.

La configuración óptima de escaneo depende en gran medida de la muestra y de la configuración y el equipo de la línea de luz. Los parámetros presentados aquí se dan como ejemplos. Un cuarto de adquisición significa una exploración en media adquisición más una exploración anular para aumentar el campo de visión lateral. Mo = molibdeno.

Ejemplo de muestra montada con agar insuficientemente compactado, permitiendo la rotación con un ligero movimiento.

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Reimpresiones y permisos

Brunet, J., Walsh, CL, Wagner, WL et al. Preparación de grandes muestras biológicas para tomografía de contraste de fase sincrotrón, jerárquica y de alta resolución con compatibilidad de imágenes multimodal. Protocolo Nacional 18, 1441-1461 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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Recibido: 21 de junio de 2022

Aceptado: 12 de diciembre de 2022

Publicado: 01 de marzo de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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